Zebra balığı, omurilik yaralanmasından kurtulma yetenekleri nedeniyle değerli bir nöral rejenerasyon modeli sunar. Bu yöntem, yüzme dayanıklılığını ve yüzme davranışını fonksiyonel omurilik onarımının okunuşları olarak tanımlar. Bu teknik, yetişkin zebra balıklarında yüzme dayanıklılığının ve yüzme davranışının güvenilir ve ölçülebilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Bu yöntemler nöromüsküler ve kas-iskelet sistemi gelişimi, hastalığı ve rejenerasyonu çalışmalarına eşit derecede uygulanabilir. Yüzme dayanıklılığını değerlendirmek için, akış hızı kontrol yazılımını açın. Deney etiketli kutuya tıklayın ve Uswim ve Uwater seçeneğinin işaretini kaldırın.
Ardından, su akım hızlarını ayarlamak için sol alttaki Uwater kutusundaki akış hızını değiştirin. Otomatik bir protokole başlamak için, Günlüğe kaydetmeyi başlat kutusunu tıklatın. Açılan iletişim penceresinde, açılır listeden Otomatik'i seçin.
Önceden kaydedilmiş bir protokol dosyasını açmak için, protokol dosyasının yanındaki dosya simgesine tıklayın. Ardından, günlük dosyasının yanındaki dosya simgesine tıklayarak çıktı dosyasını ayarlayın. Açılan dosya gezgini penceresinde, çıktı dosyasını adlandırın ve istediğiniz konuma kaydedin.
Ardından, bilgisayar ekranındaki akış hızı kontrol yazılımına ve zamanlayıcı pencerelerine eşzamanlı erişim sağlamak için bölünmüş bir tur zamanlayıcı penceresi ayarlayın. Daha sonra, yüzme tünelinden çıkarıldıktan sonra yorgun balıkları barındırmak için bir balık toplama tankı kurun. Toplama tankını ve uzun bir polivinil klorür tüpünü zebra balığı sistemi suyuyla doldurun.
Önceden doldurulmuş borunun bir ucunu toplama tankına, diğerini tampon tankına yerleştirin ve suyun tampon tankından toplama tankına serbestçe akmasını sağlayın. Su akışını önlemek için tüpün üst ucunu bir bağlayıcı klipsle kelepçeleyin ve gerektiğinde suyun çıkışını kontrol etmek için bağlayıcı klipsi kullanın. Yüzme tünelinin içine bir grup balık yerleştirmeden önce yüzme tünelini yüzme dayanıklılık kapağıyla kapatın.
Balıkları yüzme tüneline ve akış yönüne alıştırmak için, bölünmüş tur zamanlayıcısını başlatın ve mevcut hızı ilk beş dakika boyunca saniyede sıfır santimetreye, sonraki beş dakika boyunca saniyede dokuz santimetreye ve sonraki beş dakika boyunca saniyede 10 santimetreye ayarlayın. Alışmayı takiben, protokolü açın ve su akımı hızını her dakika saniyede iki santimetre artıracak olan otomatik akış hızı kontrol programını başlatın. Balıkları tükenme açısından izleyin.
Yorgun balıklar yüzme tünelinin arka ucuna doğru itilecektir. Bir balığın tükendiğinden emin olmak için, tünelin arka ucuna hafifçe dokunun veya balıkları yüzmeye teşvik etmek için o alanın üzerinde bir gölge oluşturun. Yorgun balıklar ürkütücü uyarana cevap vermedi ve tünelin arka ucunda düz bir şekilde uzandı.
Bir balık tükendiğinde, balık toplama tüpünü açın. Yüzme tüneli penceresini açın ve balıkları toplama tankında toplayın. Bölünmüş tur zamanlayıcısını kullanarak tükenme süresini kaydedin.
Tüm balıklar tükendikten ve toplama tankında toplandıktan sonra, akış hızı kontrol yazılımındaki Acil Stop düğmesine tıklayın ve zamanlayıcıyı durdurun. Yüzme davranışı testi için film çekmek için, yüzme tüneline bir grup balık yerleştirin ve standart, tamamen kapalı bir kapak kullanarak tüneli kapatın. Ardından, yeni bir kayıt penceresi açın ve dosyayı adlandırın.
Henüz Kaydet'i tıklatmayın. Yeni bir deneye başlamadan önce, tüm davranışların balıkların yüzmesinden kaynaklandığından ve ortamdaki hareketin neden olduğu irkilme tepkisinden kaynaklanmadığından emin olmak için yüzme tünelinin kenarına bir kağıt havlu veya kumaş parçası yerleştirin. Suyun sakin olduğundan ve çerçeve boyunca dalgalanma olmadığından emin olduktan sonra, film dosyasını kaydetmeye başlamak için kamera yazılımı penceresinde Kaydet'e tıklayın.
Ardından, kesintisiz olarak devam edecek olan protokolü başlatmak için akış hızı kontrol yazılımında Başlat'a tıklayın. Hiçbir karenin düşmediğinden, görüş alanında kabarcık olmadığından ve tüm balıkların kaydedildiğinden emin olmak için filmi izleyin. Film kaydı tamamlandıktan sonra, akış hızı kontrol protokolünü sonlandırmak için Acil Durdurma'ya tıklayın ve veri çıkış dosyasının otomatik olarak kaydedilip kaydedilmediğini kontrol edin.
Ardından, film dosyasını kaydetmek için kayıt penceresini kapatın. Kayıttan sonra kapağı çıkarın. Balıkları dikkatlice alın ve tanklarına geri gönderin.
Çekilen filmleri analiz etmek için tracking_v2 açın. Fiji'de ijm komut dosyası ve programı başlatmak için Çalıştır'a tıklayın. Açılır pencerede, izlenecek yüzme davranışı filmlerini içeren klasörü seçin ve Aç'a tıklayın.
İlk filmlerden birinin karesini, bir diyalog kutusunu ve ortaya çıkacak olan ilgi alanını veya yatırım getirisi yöneticisini arayın. İletişim kutusunda verilen talimatları izleyin ve yüzme tüneli odasının altında bir yatırım getirisi oluşturun. Ardından Tamam'a tıklayın ve siyah köşelerin görülmediğinden emin olun.
Eşik penceresi, düzenlenmiş bir eşikli çerçeve ile birlikte açılır. Renk düzenini siyah beyazdan kırmızıya değiştirin ve birinci çerçeve balıkları yalnızca kırmızı renkte gösterene ve başka hiçbir şey göstermeyene kadar maksimum değeri ayarlayın. Eşiği kaydedin ve iletişim kutusunda Tamam'ı tıklatın.
Hizalamak, birleştirmek ve açıklayıcı istatistikler elde etmek için SwimBehavior_v7-3'ü açın. RStudio'da R betiği ve komut dosyası bölümünün sağ üst köşesindeki Kaynak'a tıklayın. Açılan yeni bir pencerede, _raw içeren klasörü seçin.
Fiji tarafından oluşturulan csv dosyaları ve Aç'a tıklayın. Program otomatik olarak çalışacaktır. Açılır iletişim kutusunda, her filmdeki balık sayısını onaylayın.
Verilen sayılar doğruysa Evet'e, sayılar yanlışsa hayır'a tıklayın. Dosyalar hizalandıktan sonra, yeni oluşturulan bir _aligned olup olmadığını kontrol edin. csv dosyası.
Programın verileri birleştirdiğinden, istatistikleri çalıştırdığından ve çıktı grafiklerini çizdiğinden emin olduktan sonra, _raw içeren üst klasördeki Sonuçlar etiketli yeni bir klasörde oluşturulan analiz dosyalarını denetleyin. csv ve _aligned. csv dosyaları.
Yaralanma sonrası iki, dört ve altı haftada değerlendirilen yüzme dayanıklılığı, iki haftada yüzme dayanıklılığı kapasitesinde% 60'lık bir kayıp gösterdi. Yenileyici balık, yaralanmadan sonraki dört ve altı haftada yavaş yavaş yüzme dayanıklılığını geri kazandı. Yüzme davranışı testinde, kontroller yüzme tüneli odasının ön kısmında yüksek bir Y pozisyonuna karşılık gelen sabit bir şekilde yüzdü.
Buna karşılık, yaralanmadan sonraki iki haftada, yaralı balıklar akıntıya karşı sabit yüzme kapasitesini koruyamadı. Sonuç olarak, yüzme parkurları daha düzensizdir ve Y pozisyonunda genel bir azalma vardır. Y pozisyonu, yaralanmadan sonraki dört ve altı haftada artmıştır, bu da yenilenen hayvanların yavaş yavaş yüzme yeteneklerini yeniden kazandıklarını göstermektedir.
Ayrıca, yaralanmamış kontrollere göre, yaralanmadan iki hafta sonra lezyonlu hayvanlar belirgin şekilde daha az aktifti, yüzme tünelinin arka çeyreğinde durdu ve düşük akım hızlarına karşı yüzme yeteneklerini kaybetti. Fonksiyonel iyileşme elde etmek için doğuştan gelen yetenekleriyle tutarlı olarak, lezyonlu hayvanlar, yaralanma sonrası dört ve altı haftada yüzme davranışı parametrelerini kademeli olarak normalleştirmiştir. Bu protokolde akış hızı kontrol yazılımının kullanılması isteğe bağlıdır.
Alternatif, su akımı motorunu manuel olarak kontrol etmektir. Bu çalışmada açıklanan tahliller nöral, kas veya iskelet fenotiplerini ön taramak için kullanılabilir. İlgilenilen doku daha sonra histolojik veya moleküler inceleme için toplanabilir.
Laboratuvarımız ve diğerleri, doğuştan gelen nöral onarım için gerekli olan genleri ve nöral rejenerasyonu arttırmak için yeterli olan faktörleri tanımlamak için bu protokolü kullandılar.
