Il protocollo è significativo nel dimostrare la compromissione motoria del pesce zebra e un successivo recupero, a seguito di iniezione intracerebroventricolare di neurotossina 6-idrossidopamina al diencefalo ventrale. Questa tecnica dimostra i cambiamenti negli effetti funzionali, che corrispondono all'ablazione specifica dei neuroni dopaminergici nel diencefalo ventrale del pesce zebra adulto lesionato 6-OHDA, utilizzando una configurazione molto semplice. Studi futuri sui meccanismi alla base della neurorigenerazione, così come sui fattori intrinseci ed estrinseci che modulano il processo, possono fornire importanti informazioni sulle strategie di trattamento di sostituzione cellulare contro il morbo di Parkinson.
Mantenere il pesce in un serbatoio di acqua mineralizzata distillata aerata con un grammo per litro di sale marino commerciale, sotto una temperatura di controllo di 28, più o meno un grado Celsius. Ospita un massimo di 25 pesci per acquario da 45 litri e esponili a una luce di 14 ore e a un fotoperiodo scuro di 10 ore. Nutrire il pesce almeno due volte al giorno con pellet di cibo, integrati con vermi liofilizzati.
Preparare una soluzione madre di Tricaina metanosolfonato, sciogliendo due grammi e mezzo di Tricaina metanosolfonato e cinque grammi di bicarbonato di sodio in 250 millilitri di acqua distillata. Diluire due millilitri di soluzione madre per ottenere 200 millilitri di soluzione di anestesia di lavoro. Preparare appena 99,96 millimolari 6-idrossidopamina, sciogliendo prima 0,2 milligrammi di acido ascorbico in un millilitro dello 0,9% in peso per volume cloruro di sodio filtrato sterile.
Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron. Quindi aggiungere 25 milligrammi di 6-idrossidopamina, in polvere, nella soluzione. Posizionare il pesce anestetizzato su una spugna imbevuta d'acqua, posta sotto uno stereomicroscopio e bagnare regolarmente il pesce.
Identificare la posizione per l'iniezione, in base all'intersezione tra la sutura metopica, la sutura coronale e la sutura sagittale, collegando il cranio parietale e frontale del cervello del pesce zebra. Quindi fai un piccolo foro di un millimetro quadrato, usando un ago affilato di calibro 27. Abbassare l'iniettore microcapillare con un angolo di 60 gradi, fino a raggiungere una profondità di 1200 micrometri dal tetto cranico del cranio del pesce zebra.
Premere il limite Z per fissare la posizione. Impostare la pressione di iniezione iniziale su 4.000 ettopascal. Durata dell'iniezione a 2,3 secondi.
Pressione di compensazione a 10 ettopascal. Abbassare l'intensità dell'iniezione, con ogni successiva iniezione. Iniettare 0,5 microlitri di 99,96 millimolar neurotossina 6-idrossidopamina o 0,9% di peso in volume soluzione salina, nel gruppo di controllo fittizio, e lasciare riposare il microcapillare per 20 secondi.
Continuare a bagnare il pesce con acqua distillata durante tutto il processo, per evitare l'essiccazione. Rimuovere lentamente il microcapillare e rianimare il pesce sotto l'acqua distillata corrente. Metti il pesce in una vasca di recupero isolata e rimuovi eventuali distrazioni che possono potenzialmente disturbare il processo di recupero.
Lavare il microcapillare prima della successiva iniezione, per eliminare il blocco e assicurarsi che l'intensità dell'iniezione sia sufficiente per produrre il volume desiderato di 0,5 microlitri di 6-idrossidopamina. Eseguire la valutazione locomotoria del pesce zebra individualmente, tramite il test in vasca aperta, al terzo e al giorno 30, dopo la 6-idrossidopamina. Posizionare il serbatoio sperimentale, con le sue pareti ricoperte di carta bianca, su una piattaforma rialzata.
Illuminare il serbatoio dal basso, utilizzando una fonte di luce. Riempire il serbatoio con acqua distillata dall'80 al 90% e mantenere la temperatura a 28, più o meno un grado Celsius. Misurare la temperatura utilizzando un termometro e regolarla utilizzando un riscaldatore per acquari commerciale.
Dopo un minimo di due minuti di acclimatazione, registrare il comportamento di nuoto del pesce da una vista pianificata sul piano bidimensionale dell'area sperimentale, utilizzando una videocamera per cinque minuti. Per evitare incongruenze, in diversi lotti di registrazioni, non superare i 10 minuti di acclimatazione. Analizza i video utilizzando software di tracciamento video con protocollo open tank, per l'acquisizione della distanza percorsa e della velocità media di ciascun soggetto.
Il presente esperimento ha valutato i cambiamenti nel comportamento di nuoto del pesce zebra adulto, a seguito di microiniezione intracerebroventricolare con 6-idrossidopamina. La principale regione cerebrale di interesse era il diencefalo ventrale, costituito dall'area preottica, dal tubercolo posteriore e dall'ipotalamo. Più dell'85% dei neuroni dopaminergici immunoreattivi tirosina idrossilasi nel diencefalo ventrale sono stati ablati il terzo giorno dopo la recessione.
Il numero di neuroni dopaminergenici immunoreattivi tirosina idrossilasi aumenta quindi di oltre il 50% al giorno 14 postlesione, prima di raggiungere la rigenerazione completa 30 giorni dopo la lesione. L'analisi del comportamento di nuoto del pesce zebra, utilizzando un software di tracciamento video, ha indicato che sia la velocità media che la distanza percorsa del gruppo lesionato, il terzo giorno dopo la lesione, sono state significativamente ridotte a meno del 45% rispetto alla finzione. Il gruppo lesionato ha mostrato un recupero della funzione motoria, 30 giorni dopo la lesione, senza differenze significative né della velocità media né della distanza percorsa, rispetto alla sham.
È importante che la valutazione locomotoria venga eseguita entro un periodo di tempo prestabilito. Ad esempio, dalle 8:00 alle 12:00. E la temperatura dell'acqua mantenuta a 28 gradi Celsius, durante l'esperimento. Altri test comportamentali, come il shoaling e i comportamenti simili all'ansia, possono essere eseguiti, per esplorare ulteriori cambiamenti o effetti funzionali dell'ablazione dei neuroni dopaminergici, a seguito dell'iniezione 6-OHDA del cervello del pesce zebra adulto.
