O protocolo é significativo na demonstração do comprometimento motor de zebrafish e uma recuperação subsequente, após injeção intracerebroventricular de neurotoxina 6-hidroxidopamina no diencephalon ventral. Esta técnica demonstra alterações nos efeitos funcionais, que correspondem à ablação específica de neurônios dopaminérgicos no diencephalon ventral de 6-OHDA lesionado zebrafish adulto, usando uma configuração muito simples. Estudos futuros sobre os mecanismos subjacentes à neuroregeneração, bem como os fatores intrínsecos e extrínsecos que modulam o processo, podem fornecer insights importantes sobre estratégias de tratamento de reposição celular contra a doença de Parkinson.
Mantenha o peixe em um tanque de água mineralizada aerada com um grama por litro de sal marinho comercial, sob uma temperatura de controle de 28, mais ou menos um grau Celsius. Abriga um máximo de 25 peixes por tanque de 45 litros e expõe-os a um fotoperíodo escuro de 14 horas e 10 horas. Alimente os peixes pelo menos duas vezes ao dia com pelotas de comida, complementadas com vermes secos congelados.
Prepare uma solução de estoque de metano tricaine, dissolvendo dois gramas e meio de metanos tricaine e cinco gramas de bicarbonato de sódio em 250 mililitros de água destilada. Diluir dois mililitros de solução de estoque para fazer 200 mililitros de solução de anestesia de trabalho. Prepare recentemente 99,96 milimonas 6-hidroxidopamina, dissolvendo primeiro 0,2 miligramas de ácido ascórbico em um mililitro de 0,9% de peso em volume estéril filtro cloreto de sódio.
Filtre a solução com um filtro de 0,2 mícbio. Em seguida, adicione 25 miligramas de 6-hidroxidopamina, em forma de pó, na solução. Posicione o peixe anestesiado em uma esponja encharcada de água, colocado sob um microscópio estéreo e molhe o peixe regularmente.
Identifique a posição para injeção, com base na intersecção entre a sutura metópica, sutura coronal e sutura sagital, conectando o crânio parietal e frontal do cérebro de zebrafish. Em seguida, faça um pequeno buraco de um milímetro ao quadrado, usando uma agulha afiada de calibre 27. Abaixe o injetor microcapilar em um ângulo de 60 graus, até atingir uma profundidade de 1200 micrômetros do teto craniano do crânio do zebrafish.
Pressione o limite Z para fixar a posição. Coloque a pressão inicial de injeção em 4.000 hectopascal. Duração da injeção em 2,3 segundos.
Pressão de compensação para 10 hectopascal. Abaixe a intensidade da injeção, a cada injeção subsequente. Injete 0,5 microlitres de 99,96 milimonas neurotoxinas 6-hidroxidopamina ou 0,9% de peso em soro fisiológico de volume, no grupo de controle falso, e deixe o microcapilar descansar por 20 segundos.
Continue molhando o peixe com água destilada durante todo o processo, para evitar a secagem. Remova lentamente o microcapilar e ressuscite o peixe sob água destilada. Coloque o peixe em um tanque de recuperação isolado e remova quaisquer distrações que possam potencialmente perturbar o processo de recuperação.
Lave o microcapilar antes da próxima injeção, para limpar o bloqueio e garantir que a intensidade da injeção seja suficiente para produzir o volume desejado de 0,5 microlitrais de 6-hidroxidopamina. Realizar avaliação locomotor de zebrafish individualmente, através do teste do tanque aberto, no terceiro e dia 30, pós 6-hidroxidopamina. Coloque o tanque experimental, com suas paredes cobertas com papel branco, em uma plataforma elevada.
Ilumine o tanque de baixo, usando uma fonte de luz. Encha o tanque com 80 a 90% de água destilada e mantenha a temperatura em 28, mais ou menos um grau Celsius. Meça a temperatura usando um termômetro e regular-a usando um aquecedor de aquário comercial.
Após um mínimo de dois minutos de aclimatação, registre o comportamento de natação de peixes a partir de uma visão planejada no plano bidimensional da área experimental, usando uma câmera de vídeo por cinco minutos. Para evitar inconsistências, em diferentes lotes de gravações, não exceda 10 minutos de aclimatação. Analise os vídeos usando software de rastreamento de vídeo com o protocolo open tank, para aquisição de distância percorrida e velocidade média de cada assunto.
O presente experimento avaliou as mudanças no comportamento de natação de zebrafish adulto, após microinjeção intracerebroventricular com 6-hidroxidopamina. A principal região de interesse cerebral foi o diencephalon ventral, composto pela área preóptica, tubérculo posterior e hipotálamo. Mais de 85% dos neurônios imunoretivos da hidroxilase de tyrosina no diencephalon ventral foram ablados no terceiro dia de pós-selagem.
O número de neurônios imunoretivos imunoretivos de tyrosina aumentam mais de 50% no dia 14 pós-selesão, antes de atingir a regeneração total de 30 dias de pós-escoamento. A análise do comportamento de natação de zebrafish, utilizando software de rastreamento de vídeo, indicou que tanto a velocidade média quanto a distância percorrida do grupo lesionado, no terceiro dia de pós-escoar, foram significativamente reduzidas para menos de 45% quando comparadas à farsa. O grupo lesionado apresentou recuperação da função motora, 30 dias de pós-estação, sem diferença significativa da velocidade média ou da distância percorrida, quando comparada à farsa.
É importante que a avaliação locomotor seja realizada dentro de um prazo fixo. Por exemplo, das 8:00 às 12:00. E a temperatura da água manteve-se em 28 graus Celsius, durante todo o experimento. Outros testes comportamentais, como cardumes e comportamentos semelhantes à ansiedade, podem ser realizados, para explorar alterações adicionais ou efeitos funcionais da ablação de neurônios dopaminérgicos, após a injeção 6-OHDA do cérebro adulto de zebrafish.
