Das Protokoll ist signifikant für den Nachweis einer motorischen Beeinträchtigung des Zebrafisches und einer anschließenden Erholung nach intrazerebroventrikulärer Injektion von Neurotoxin 6-Hydroxydopamin am ventralen Zwischenhirn. Diese Technik zeigt Veränderungen in den funktionellen Effekten, die der spezifischen Ablation von dopaminergen Neuronen im ventralen Zwischenhirn von 6-OHDA-läsionierten erwachsenen Zebrafischen entsprechen, wobei ein sehr einfacher Aufbau verwendet wird. Zukünftige Studien zu den Mechanismen, die der Neuroregeneration zugrunde liegen, sowie zu den intrinsischen und extrinsischen Faktoren, die den Prozess modulieren, können wichtige Erkenntnisse über Zellersatzbehandlungsstrategien gegen die Parkinson-Krankheit liefern.
Pflegen Sie den Fisch in einem belüfteten destillierten mineralisierten Wassertank mit einem Gramm pro Liter kommerziellem Meersalz unter einer Kontrolltemperatur von 28 plus oder minus einem Grad Celsius. Nehmen Sie maximal 25 Fische pro 45-Liter-Tank auf und setzen Sie sie einer 14-stündigen Licht- und 10-stündigen dunklen Photoperiode aus. Füttern Sie die Fische mindestens zweimal täglich mit Futterpellets, ergänzt mit gefriergetrockneten Würmern.
Bereiten Sie eine Stammlösung von Tricainmethansulfonat vor, indem Sie zweieinhalb Gramm Tricainmethansulfonat und fünf Gramm Natriumbicarbonat in 250 Milliliter destilliertem Wasser auflösen. Verdünnen Sie zwei Milliliter Stammlösung, um 200 Milliliter Arbeitsanästhesielösung herzustellen. Frisch hergestellt 99,96 Millimolar 6-Hydroxydopamin, indem zuerst 0,2 Milligramm Ascorbinsäure in einem Milliliter 0,9% Volumengewicht steril gefiltertes Natriumchlorid gelöst werden.
Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-Mikron-Filter. Dann fügen Sie 25 Milligramm 6-Hydroxydopamin in Pulverform in die Lösung hinzu. Positionieren Sie den betäubten Fisch auf einem wassergetränkten Schwamm, der unter ein Stereomikroskop gelegt wird, und befeuchten Sie den Fisch regelmäßig.
Identifizieren Sie die Position für die Injektion, basierend auf dem Schnittpunkt zwischen der metopischen Naht, der koronalen Naht und der sagittalen Naht, die den parietalen und frontalen Schädel des Zebrafischgehirns verbindet. Dann machen Sie ein kleines Loch von einem Millimeter im Quadrat mit einer scharfen 27-Gauge-Nadel. Senken Sie den Mikrokapillarinjektor in einem Winkel von 60 Grad ab, bis er eine Tiefe von 1200 Mikrometern vom Schädeldach des Zebrafischschädels erreicht.
Drücken Sie das Z-Limit, um die Position zu fixieren. Stellen Sie den anfänglichen Injektionsdruck auf 4.000 Hektopascal ein. Dauer der Injektion bei 2,3 Sekunden.
Kompensationsdruck auf 10 Hektopascal. Senken Sie die Intensität der Injektion mit jeder nachfolgenden Injektion. Injizieren Sie 0,5 Mikroliter 99,96 Millimolar Neurotoxin 6-Hydroxydopamin oder 0,9% Volumengewicht Kochsalzlösung in der Scheinkontrollgruppe und lassen Sie die Mikrokapillare für 20 Sekunden ruhen.
Befeuchten Sie den Fisch während des gesamten Prozesses weiterhin mit destilliertem Wasser, um ein Austrocknen zu verhindern. Entfernen Sie langsam die Mikrokapillare und beleben Sie den Fisch unter fließendem destilliertem Wasser. Legen Sie den Fisch in ein isoliertes Auffangbecken und entfernen Sie alle Ablenkungen, die den Genesungsprozess stören können.
Spülen Sie die Mikrokapillare vor der nächsten Injektion, um die Blockade zu beseitigen und sicherzustellen, dass die Intensität der Injektion ausreicht, um das gewünschte Volumen von 0,5 Mikrolitern 6-Hydroxydopamin zu erhalten. Führen Sie die lokomotorische Beurteilung von Zebrafischen einzeln über den offenen Tanktest am dritten Tag und am 30. Tag nach 6-Hydroxydopamin durch. Stellen Sie den Versuchstank mit seinen mit weißem Papier bedeckten Wänden auf eine erhöhte Plattform.
Beleuchten Sie den Tank von unten mit einer Lichtquelle. Füllen Sie den Tank mit 80 bis 90% destilliertem Wasser und halten Sie die Temperatur bei 28, plus oder minus einem Grad Celsius. Messen Sie die Temperatur mit einem Thermometer und regulieren Sie sie mit einer handelsüblichen Aquarienheizung.
Nach mindestens zwei Minuten Akklimatisierung zeichnen Sie das Schwimmverhalten der Fische aus einer geplanten Ansicht auf der zweidimensionalen Ebene des Versuchsgebiets mit einer Videokamera für fünf Minuten auf. Um Inkonsistenzen zu vermeiden, überschreiten Sie in verschiedenen Chargen von Aufnahmen nicht 10 Minuten Akklimatisierung. Analysieren Sie die Videos mit Video-Tracking-Software mit dem Open-Tank-Protokoll, um die zurückgelegte Strecke und die mittlere Geschwindigkeit jedes Subjekts zu erfassen.
Das vorliegende Experiment untersuchte die Veränderungen des Schwimmverhaltens von erwachsenen Zebrafischen nach einer intrazerebroventrikulären Mikroinjektion mit 6-Hydroxydopamin. Die wichtigste Hirnregion von Interesse war das ventrale Zwischenhirn, bestehend aus dem präoptischen Bereich, dem hinteren Tuberkulum und dem Hypothalamus. Mehr als 85% der immunreaktiven dopaminergen Neuronen der Tyrosinhydroxylase im ventralen Zwischenhirn wurden am dritten Tag nach der Läsion abgetragen.
Die Anzahl der immunreaktiven dopaminergenen Neuronen der Tyrosinhydroxylase nimmt dann am Tag 14 nach der Läsion um mehr als 50% zu, bevor sie 30 Tage nach der Läsion eine vollständige Regeneration erreicht. Die Analyse des Schwimmverhaltens von Zebrafischen unter Verwendung von Video-Tracking-Software ergab, dass sowohl die mittlere Geschwindigkeit als auch die zurückgelegte Strecke der läsionierten Gruppe am dritten Tag nach der Läsion im Vergleich zur Scheinuntersuchung signifikant auf weniger als 45% reduziert waren. Die läsionierte Gruppe zeigte eine Erholung der motorischen Funktion, 30 Tage nach der Läsion, ohne signifikanten Unterschied zwischen der mittleren Geschwindigkeit oder der zurückgelegten Strecke im Vergleich zur Täuschung.
Es ist wichtig, dass die Beurteilung des Bewegungsapparates innerhalb eines festgelegten Zeitrahmens durchgeführt wird. Beispiel: 08:00 Uhr bis 12:00 Uhr. Und die Wassertemperatur blieb während des gesamten Experiments bei 28 Grad Celsius. Andere Verhaltenstests, wie Schwärmen und angstähnliche Verhaltensweisen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Veränderungen oder funktionelle Auswirkungen der dopaminergen Neuronenablation nach 6-OHDA-Injektion des erwachsenen Zebrafischgehirns zu untersuchen.
