Bu protokol, tümör hücresi genişlemesi için bir temel sağlar ve bu da tümör hücresi fonksiyonunun ve genomik durumların derinlemesine incelenmesine izin verir. Ek olarak, tümörün bağışıklık tepkisi üzerindeki etkisini değerlendirmek için in vitro bir model sistemi sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hasta dokusundan mezotelyal tümör hatlarının oluşturulması için temel bir protokol sağlamasıdır.
Şu anda bu model sistem için standartlaştırılmış bir protokol yoktur. Bu tekniğin en zor yanı, erken geçiş kültürlerinde fibroblast kontaminasyonunun varlığıdır. Fibroblast açlık girişimlerinin işe yarayıp yaramadığını belirlemek için fibroblastlara karşı tümör hücresi morfolojisi hakkında sağlam bir anlayışa sahip olmak çok önemlidir.
10 mililitre tümör sindiren enzimatik kokteyli bir ayrışma tüpüne aktararak başlayın. Tümör dokusu parçasını steril bir neşter kullanarak steril altı kuyucuklu bir plaka kapağına aktarın. Yeni bir steril neşter ve forseps kullanarak tüm yağlı nekrotik dokuları ve kan pıhtılarını çıkarın.
Tüm tümör dokusunu bir milimetreküp küçük parçalara ayırın. Dokunun kurumamasını sağlamak için, tümör dokusuna 500 mikrolitre steril Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi veya HBSS ekleyin. Tümör fragmanlarını, enzimatik kokteyli sindiren 10 mililitre tümör içeren ayrışma tüpüne aktarın.
Tüpü sıkıca kapatın. Kapağı doku ayrıştırıcısının üzerine yan yana yerleştirin ve ayrışıcıya ısı sağlayın. Ayrıştırıcıdaki önceden programlanmış ayarı 37 santigrat derece insan tümörü ayrışma kiti ayarı 1'e seçin ve yanıp sönen kırmızı ışıkla tıkanma hatasının belirtilmediğinden emin olmak için 10 dakika sonra durumu kontrol edin.
Bir saat sonra, ayrışma tüpünü çıkarın ve laminer bir akış başlığına yerleştirin. 50 mililitrelik bir konik tüp üzerine 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirerek ve sindirilen tümörü filtreye 10 mililitrelik bir pipet kullanarak pipetleyerek sindirilmiş tümörü filtreleyin. Filtre tıkanırsa, yeni bir filtreye geçin.
Ayrışma tüpünü 10 mililitre taze tümör sindirim ortamı ile durulayın ve filtreden yıkayın. Filtreyi çıkarın ve atın. Tümör sindirim ortamı ile toplam hacmi 40 mililitreye getirin.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. Bir vakum kaynağına bağlı iki mililitrelik aspire edici bir pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin ve 10 mililitre steril tümör ortamı kullanarak hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, yine, tüpleri santrifüj edin ve gösterildiği gibi süpernatantı aspire edin.
Daha sonra, hücreleri üç mililitre steril tümör ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu steril altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Plakayı% 5 karbondioksit ile 37 derecede bir inkübatörde tutun. 24 saat sonra, kullanılan ortamı sindirilmiş tümörden aynı altı kuyucuklu plakadaki yeni bir kuyuya aktarın, ardından üç mililitre steril tümör ortamını bir kuyuya ekleyin.
Ters faz mikroskobu kullanarak, erken geçiş kültüründe fibroblast kontaminasyon yüzdesini belirleyin. Fibroblast kontaminasyonu, erken geçiş kültüründeki hücrelerin% 20'sinden fazlaysa, tümör ortamını indirgenmiş serum ortamı ile değiştirdikten sonra kültürlemeye devam edin. Fibroblast popülasyonu% 10 veya daha azına indirgenmezse, serum içeren ortamı çıkarmak için kuyuyu PBS ile hafifçe durulayın.
Altı kuyucuklu bir plakaya kuyucuk başına bir mililitre tripsin ekleyin. Altı kuyucuklu plakayı veya şişeyi bir dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı veya şişeyi inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışmasını kontrol edin.
Hücreler kısmen kaldırılırken veya yüzerken, askıya alınmış hücreleri ve tripsin sadece yavaşça çıkarın. Hücreleri, eşit veya daha büyük hacimli tam tümör ortamı içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin. Üç ila dört fraksiyon çıkarılana kadar tripsinizingi tekrarlayın.
Tüm bağımsız fraksiyonları oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Bir vakum kaynağına bağlı iki mililitrelik aspire edici bir pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Hücreleri beş mililitre steril azaltılmış serum ortamı kullanarak yeniden askıya alın.
Hücreleri her fraksiyon için bir T-25 şişesine yerleştirin ve şişeleri 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Erken geçiş hücrelerinin kriyoprezervasyonu için, bir tüp aliquoted dondurulmuş ortamı çözülür. Önce plakayı PBS ile yıkayarak ve daha önce gösterildiği gibi tripsin ekleyerek tripsinizasyon yoluyla hücreleri toplayın.
Şişeyi üç dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin yapışmasını kontrol edin. Hücreler kalkıyor veya yüzüyorsa, asılı hücreleri ve tripsinimi yavaşça çıkarın.
Hücreleri, eşit veya daha büyük hacimli tam tümör ortamı içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin. Tüpün içeriğini yavaşça pipetleyerek karıştırın. Saymak için 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu çıkarın.
Daha sonra kalan hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin. Hücreler dönerken, tripan mavisi veya akridin turuncu / propidium iyodür gibi laboratuvara özgü bir sayma protokolü kullanarak sayın. Dondurucu ortamda santrifüjlemeyi takiben hücreleri, mililitre dondurucu ortam başına altıncı hücrelere en az 5 x 10 ile yeniden askıya alın ve bu hücre süspansiyonunun bir mililitresini önceden etiketlenmiş 1.5 mililitre kriyovyallere aktarın.
Kriyovalleri kontrollü bir donma odasına yerleştirin ve hemen eksi 80 santigrat dereceye aktarın. Şekil, fibroblast kontaminasyonu olmayan bir kültüre kıyasla% 80 ve% 30'luk artan fiberblast kontaminasyonunu göstermektedir. Bu şekil, dört primer mezotelyoma tümör hattının, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H ve bir melanom tümör hattının, MEL526'nın negatif kontrol olarak temsili akış sitometrisi yüzey boyamasını göstermektedir.
Bu hücre hatları hem mezotelin hem de N-kadherini eksprese edebilir. Enzimatik ayrılmanın yüzey proteini belirteci ekspresyonu üzerindeki etkisinin test edilmesinin önemi, hem tripsin hem de proteaz kollajenaz karışımının N-kadherinin yüzey ekspresyonunun kaybına neden olurken, CD90'ın etkilenmemesi nedeniyle de gösterilmiştir. Önemli adımlar, sindirimden önce kan ve yağın uzaklaştırılması, fibroblast kontaminasyonunun tanımlanması ve fibroblast aşırı büyümesinin nasıl sınırlandırılacağının belirlenmesi dahil olmak üzere tümörün uygun şekilde işlenmesini içerir.
Bu prosedürü takip eden önemli bir yöntem, otolog T hücrelerinin hasta kaynaklı tümör hücrelerini tanıma yeteneğini test etmek için sitotoksik lenfosit testlerini içerir. Bu teknik, terapötik öneme sahip olabilecek yeni anti-tümör spesifik T hücresi reseptörlerini tanımlayacaktır. Ek olarak, tümör ve eşleştirilmiş tümör infiltrasyonu lenfositler ve immün disfonksiyon arasındaki etkileşimi incelememize izin verecektir.
