Yaşayan bir biyobankanın yaratılması ve sürdürülmesi. Giriş. Geleneksel biyobankalar genellikle canlı olmayan doku ve kan örnekleri içerir. Kanser hasta popülasyonlarının çeşitliliğini yeterince yansıtmasına ve genetik ve histolojik analizlere izin vermesine rağmen, terapötik stratejileri değerlendiren preklinik tahliller için uygun değildir.
Hasta kaynaklı modelleri de entegre eden bir biyobanka bu sınırlamaların üstesinden gelmektedir. Böylece hassas tıp için fonksiyonel testlere olanak tanır. Örnek alımı.
Kolorektal ve pankreas kanserinin biyobankası için, tanısı kanıtlanmış ve yeterli tümör büyüklüğüne sahip olguların seçilmesi, hastanın bilinçli konsensüse alınması zorunludur. Ameliyat başlamadan önce, heparinize bir şırıngar kullanarak 20ml kan ve serum monovet ile ek 7.5ml çekin. Serum işleme ve PBL izolasyonu.
1, 128 RCF'de 15 dakika dört derecede santrifüjlendikten sonra serum önceden etiketlenmiş bir kriyotüpte aliquoted edilir ve doğrudan sıvı nitrojene batırılır. Heparinize kan bir polipropilen tüpe aktarılır ve 15ml PBS ile seyreltilir. Karışımı yavaşça 15ml Pancoll ile kaplamak için serolojik bir pipet kullanın.
Yoğunluk gradyan santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücreleri içeren opak tabaka serolojik bir pipetle alınır ve yeni bir PP tüpüne aktarılır. PBS ile yıkadıktan ve mononükleer hücreleri santrifüjleme ile peletledikten sonra, süpernatantı atın ve peleti dondurucu ortamına yeniden atın ve önceden etiketlenmiş kriyotüplere dağıtın. Tüpleri dakikada bir derece ile yavaş dondurmaya uygun bir soğutma kabına aktarın ve geçici olarak 80 derecede saklayın.
Doku işleme. Doku örneği cerrah tarafından resected edilir etmez, uygun bir kaba koyun. Her koşulda dokunun formalinle kaplı olduğundan kaçının.
Rezeksiyon marjlarının patolojik değerlendirmesi ile ilgili olmayan tümör materyalinin eksizyonu için patolojiye mümkün olduğunca hızlı taşınma. Tümör parçası mümkün olduğunca aseptik olarak ele alınmalıdır. Ayrıca, sağlıklı bir doku örneği elde edin ve her ikisini de buz üzerinde doku depolama çözeltisi ile önceden doldurulmuş ayrı tüplere yerleştirin.
Steril koşullar altında doku işlemeye başlamak için hemen laboratuvara dönün. Doku parçası, oluşmayı önlemek için doku depolama çözeltisi ile dolu steril bir plastik kabın üzerine yerleştirilir. Her şeyden önce, elde edilen doku örneğinin boyutuna bağlı olarak çıtçıt dondurma için bir veya daha fazla iğne ucu büyüklüğünde parçayı dışarı atın.
Yerel dokuyu önceden etiketlenmiş kriyotüplere yerleştirin ve hemen sıvı nitrojene batırın. Kalan dokuyu üçe üç, üç milimetreküp küp küpler halinde kesin. Nekrotik dokunun tamamen parçalanıp atılmaması gerektiğini göz önünde bulundurarak.
Hayati depolama için aliquot sayısını belirlemek için küpleri dört katına yerleştirin. Yeterli sayıda kriyotüs etiketleyin ve her biri 1,5 ml dondurucu ortamıyla önceden doldurun. Dondurucu ortamındaki DMSO sitotoksik olduğundan, sonraki adımları hızlı ve kesintisiz bir şekilde gerçekleştirdi.
Tüp başına dört doku parçası toplamak için neşter bıçakları kullanın. Tüm parçaların tamamen tüpün dibinde ideal olarak dondurucu ortamına batırıldığından emin olun ve dondurucu bir kap kullanarak tüpleri hızla dondurun. Sağlıklı örnekle aynı şekilde devam edin.
Uzun süreli depolama için, tüm aliquotes sıvı azot tankında saklayın. Hücre kültürü. Nekrotik kısımlar da dahil olmak üzere tümör dokusu işleme kalıntılarını neşter bıçakları ile mümkün olduğunca küçük öğütün.
Steril bir PP tüpünün üstüne bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süzgecinden geçmek için süspansiyonu serolojik bir pipetle aspire edin. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için doku kalıntılarını hücre süzgecinden geçirmek için tek kullanımlık şırınnanın pistonunu kullanın. PBS ile durulayın ve malzeme kalana kadar bu adımları tekrarlayın.
Hücre süzgecini çıkarın ve süspansiyonu 180 RCF'de yedi dakika santrifüjleyin. Bu arada, tümörün büyüme olasılığını artırmak için farklı ortam kompozisyonlarına sahip kollajen ön kaplamalı altı kuyu plakası hazırlayın. Süpernatantı atın ve peleti PBS'de yeniden atın ve kuyu başına 500 mikrolitre dağıtın.
Daha sonra, plakayı standart bir inkübatöre yerleştirin. Hasta kaynaklı ksinograft üretimi. İmmün sistemi baskılanmış farelerde hasta kaynaklı ksinograftların üretimi için hayvanlar belirli bir patojen içermeyen ortamda tutulmalıdır.
Önlük, önlük, yüz maskesi, saç örtüsü ve eldivenlerden oluşan kişisel koruyucu ekipman giyin. Çalışma alanınızı düzenledikten sonra, sıvı nitrojen kabından istenen tümör örneğini alın. Taze bir PP tüpünü 35ml PBS ile doldurun, ardından çözülme işlemini dikkatlice yıkayın ve kriyo tüpünü yukarı ve aşağı eğin.
İçerik sulu hale gelir gelmez PBS'ye dökülür ve tümör parçalarını durulayın. PBS'nin çoğunu atın ve küpleri kapağın içine boşaltın. Bir buz torbasına steril bir plastik tabak yerleştirin ve 100 mikroliter Matrigel damlacık ekleyin.
Tümör parçalarını Matrigel'e yerleştirmek ve tümörü 10 dakika kuluçkaya yatırmak için forseps kullanın. Bu arada, iki fareyi uyuşturun. Hayvanın ayağını çimdikleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin.
Herhangi bir hareket anestezinin yetersiz olduğunu gösterir ve biraz bekleme veya ek dosing gerektirir. Göz merhemi uygulayın, fareyi boynundan kıstırın ve deri altından bir mikroçip enjekte edin. Aşağıdaki adımları paralel olarak uygulayın.
Farelerin kanatlarını dezenfekte edin ve şeritli Metzenbaum makası ile küçük bir cilt kesisi yapın ve künt bir hazırlıkla deri altı bir cep oluşturur. Tümör parçalarını yerleştirmek için anatomik tokmaklar kullanın. Parçanın cilt cebinin arka ucuna yerleştirildiğından emin olun.
Kalan Matrigel'i arzula ve dört cebe de eşit olarak dağıt. Jelin iyileşmesini bekliyor ve iğne ile tümör parçalarına zarar vermeden tek düğmeli dikişlerle cildi kapatın. İpliği düğümün üzerinde mümkün olduğunca kısa kesin ve dikişlerin noying önlemek için sprey pansuman uygulayın.
Mikroçipi tarayın ve hayvanın daha sonra tanımlanması için tümör bilgilerini veritabanına ekleyin. Taze yatak takımı ve yuva malzemesi ile bir kafes hazırlayın, fareleri kızılötesi bir lambanın önüne yerleştirin ve anestezi geçene kadar hayvanı izleyin. PDX'in çıkarılması.
PDX tümörü gerekli boyuta ulaştıktan sonra, fare CO2 boğulması ve daha sonra servikal çıkık ile ötenaziye tabi tökezler. Cildi tümörden dikkatlice parçalara çıkarın ve PDX'i tamamen çıkarın. Temsili sonuçlar.
Steril bir plastik kabın üzerine bir tümör yerleştirin ve daha fazla işlem için steril neşter bıçakları kullanın. Dilimlerle delik açın, bir histoloji kasetine yerleştirin ve daha sonra histolojik değerlendirme için parafin gömülü numune oluşturmak için formalin içine batırın. Tümörün geri kalanını doku depolama çözeltisine aktarın ve biyobanka için hayati derecede korunmuş yeni donmuş numuneler oluşturun.
Ayrıca, ikincil tümör hücre hatlarını belirlemek için pdx tümörünün kalıntılarını bölüm hücre kültürüne benzer şekilde kullanın. Daha fazla PDX oluşturmak için Matrigel ile iki veya daha fazla tümör parçasını daha önce gösterildiği gibi yeni bir alıcı fareye aktarın. Sonuç. Sunulan protokol sayesinde, şimdiye kadar dokuz pankreas ve 100'den fazla kolorektal hasta kaynaklı kanser hücre hattının yanı sıra 19 pankreas ve 150'den fazla kolorektal PDX modeli kurmayı başardık.
