Kistik fibrozis hastaları için bireyselleştirilmiş tedavi, CFTR aktivitesini başlangıçta anlamak için in vitro hastalık modeli ile sağlanabilir. İnsan nazal epitelyal organoidleri veya HNE organoidleri, CFTR aktivitesi ile ilişkili çeşitli boyutlarda lümenler üretir ve CF ve CF olmayan organoidleri ayırt eder. Burada, bu HNE organoidlerinin kültürlenmesi ve görüntülenmesi için bir metodolojiyi ayrıntılı olarak tanımladık.
İşlevsel olmayan epitel iyon taşınması, özellikle klorür ve bikarbonat, epitel astar sıvılarının hacminin azalmasına neden olur. Bu aynı zamanda mukostaz ve obstrüksiyona yol açan mukus sekresyonlarını da etkiler. Bu nedenle, HNE modelimiz, araştırmacının deneysel tasarımına ve kaynaklarına bağlı olarak çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir.
CFTR aktivitesini başlangıçta veya terapötiklere yanıt olarak değerlendirmenin yanı sıra, bu teknik epitel hücre fonksiyonunu içeren diğer hastalıklara, özellikle epitel hücre sıvısı taşınımına da uygulanabilir. Bu yöntemler öncelikle kistik fibroz çalışmalarında kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Primer siliyer diskinezi gibi hava yolu epitelini değerlendiren diğer çalışmalar da bu yöntemleri yararlı bulabilir.
Bu teknikler detaylara ve hassasiyete dikkat etmeyi gerektirir. Ayrıca, hücrelerin ilk genişlemesinin uygun olduğundan emin olmak için dikkatli bir gözlem gerektirirler. Tüm kültürleri her gün izleyin ve başarı daha muhtemel olacaktır.
Başlamak için, burun fırçası biyopsisini, sitoloji fırçasını bir mililitrelik büyük delikli pipet ucundan birkaç kez geçirerek 15 mililitrelik bir konik tüp içinde 8 militer RPMI ortamına ayırın. Hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve ardından hücre peletini üç mililitre hücre ayrılma çözeltisi içinde yeniden askıya alın.
Sindirmek için oda sıcaklığında 16 dakika inkübe edin. Hücreleri iki kez yıkamak için beş mililitre genleşme ortamı kullanın. Ardından, ışınlanmış, inaktive edilmiş ve% 50 ila% 60 akıcı 3T3 fibroblastları ile önceden tohumlanmış bir T75 şişesine ekleyin.
Hücrelerin 7 ila 14 gün boyunca genişleme ortamında birlikte kültürlenmesine ve genişlemesine izin verin. Kistik fibrozlu hastalardan elde edilen hücreler için antibiyotikler kullanılmışsa, ilk üç günlük kültürden sonra ortam antibiyotiksiz genişleme ortamı ile değiştirilmelidir ve% 80 birleşene kadar her iki günde bir ortam değiştirmeye devam edebilir. Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın.
Daha sonra, T75 şişesine 1.5 mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastını kültürden çıkarmak için 37 santigrat derecede dört dakika inkübe edin. Kalan 3T3 fibroblastlarını iyice yıkamak için T75 şişesini 1x DPBS ile iki kez durulayın. T75 şişesine 1,5 mililitre% 0,05 tripsin-EDTA ekleyin ve HNE'leri ayırmak için 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.
Tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile bire bir oranında nötralize edin. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez gi'de santrifüj edin. Ardından, süpernatantı atın ve hücreleri bir kez beş mililitre genleşme ortamı ile yıkayın.
Hücreler artık organoidleri büyütmek için tohumlamaya hazırdır. Organoid kültür hücre dışı matrisini veya ECM'yi gece boyunca dört santigrat derecede çözün. 15 kuyucuklu anjiyogenez slaytlarını gece boyunca aynı sıcaklıkta soğutun.
Ardından, pipet uçlarını dört santigrat dereceye kadar soğutun. Kızakları buz üzerinde beş mikrolitre soğuk% 100 ECM ile kaplayın. Konsolidasyon için en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
Bir hemositometre kullanarak ko-kültürden toplanan HNE'leri sayın. Daha sonra, hücreleri toplam sayıda mikrolitre başına 500 hücreye seyreltin,% 20 ECM buz üzerindeki farklılaşma ortamı ile seyreltilir. ECM kaplı kızakları inkübatörden çıkarın ve soğuk hücre ECM karışımının beş mikrolitresini kuyucukların her birine tohumlayın.
Hücre ECM karışımını birleştirmek için slaytları derhal 37 santigrat derecede bir kültür inkübatörüne bir saat boyunca aktarın. Bundan sonra, slaytları inkübatörden çıkarın ve hücreleri, 50 mikrolitre farklılaşma ortamı ile 15 kuyucuklu anjiyogenez slaytlarının her bir kuyucuğuna besleyin. Slaytı 37 santigrat derecede kültür inkübatörüne geri döndürün, organoidler daha fazla deney için hazır olana kadar medyayı her gün değiştirin.
8 delikli cam tabanlı hazne kızaklarına hücre yapıştırıcısı ile 30 dakika boyunca ön işlem yapın. Çözeltiyi atın ve kuyucukları 30 dakika daha havayla kurulayın. Ardından, ortamı ECM'nin üstünden atın ve ardından buz üzerindeki 15 kuyucuklu kızakların her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre soğuk 1x PBS ekleyin.
Büyük delikli pipet ucunun 200 mikrolitresini kullanarak üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipet alın. Çözeltiyi, 8 delikli oda kızaklarının bir kuyusunun ortasına dağıtın. Fazla sıvıyı hemen kuyucuklardan ince uçlu bir pipetle çıkarın.
Ardından, cam tabana yapışan organoidi arttırmak için odayı 40 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. 40 dakika sonra, organoidleri iki kez 1x PBS ile nazikçe yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her bir kuyucukta 300 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. 1x PBS ile iki kez yıkayın ve organoidleri iki haftaya kadar immün boyama için dört santigrat derece ayarlanmış 1x PBS'de saklayın.
Histolojik çalışmalar için organoidleri toplamak için, medyayı kültürden çıkarın ve buz üzerindeki slaytların her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre soğuk bir 1x PBS ekleyin. 200 mikrolitrelik büyük delikli pipet ucu kullanarak üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipet alın. 15 delikli sürgü veya kültür eklerindeki tüm çözeltileri buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin.
Soğuk 1x PBS ekleyerek tüpteki toplam çözelti hacmini 10 mililitreye ayarlayın. Tüpü dört santigrat derecede, beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Daha sonra, süpernatantı aspire edin ve 200 mikrolitrelik büyük delikli pipet ucu kullanarak organoid pelet ile karıştırmak için 60 mikrolitre ılık histojel ekleyin.
Süspansiyonu hemen bir histoloji kalıbına aktarın. Histojeli oda sıcaklığında birleştirdikten sonra, kalıp bloğunu gece boyunca dört santigrat derecede sabitlemek için% 4 paraformaldehit içine koyun. Yazılımı açın ve ekranın altına sağ tıklayın.
Ardından, Analiz Kontrolleri'ni ve ardından Otomatik Ölçüm Sonuçları'nı seçin. Organoid görüntüyü açın ve görünür lümenli 5 ila 10 organoid seçin. Menüyü açmak için resme sağ tıklayın ve organoidin toplam yüzey alanını elde etmek üzere tam organoidi özetlemek için Poligonal YG'yi seçin.
Ardından, lümen alanını elde etmek için lümeni ana hatlarıyla belirtin. Bunu kuyudaki kalan organoidler ve tahlildeki tüm kuyular için tekrarlayın. Son olarak, verileri Excel'e aktarın.
Lümen alanını toplam yüzey alanına bölün ve Temel Lümen Oranını elde etmek için numunedeki tüm organoidlerin ortalamasını alın. Parlak alan görüntüleri, başarılı ve başarısız bir numune koleksiyonundan HNE'leri temsil eder. HNE'ler büyük bir kümede iyi büyür.
Buna karşılık, HNE'ler ışınlanmış 3T3 hücrelerini çevreleyen iki küçük kümede zayıf büyür. 15 delikli slayttaki organoidler, kültür ekindekilerden daha hassas ve keskin görüntülere sahiptir. Bunun yanı sıra bu iki kültür yönteminde anlamlı bir morfolojik farklılık gözlenmedi.
CF olmayan organoidler tipik olarak CF organoidlerinden daha büyük bir lümene ve daha sıvıya sahiptir. CF olmayan, F508del/F508del deneğinden organoidlerde HNE boyaması ve bir organoiddeki kirpiklerin immünofloresan boyanması bu görüntülerde gösterilmiştir. Asetile tübülin ile boyanmış kirpikler, FITC etiketli sekonder antikor ve DAPI ile etiketlenmiş çekirdekler burada gösterilmiştir.
İki temsili organoidin tam montajlı immünofloresan boyama ile maksimum projeksiyon görüntüleri ve bunlara karşılık gelen üç boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleri burada gösterilmiştir. Organoidlerin lümeni içindeki mukus ve kirpikler gösterilmiştir. Grafik görüntüler, primer nazal epitel hücrelerinde CFTR fonksiyonunu test etmek için forskolin kaynaklı şişlik testini temsil eder.
Burada KF olmayan gönüllülerin temsili bir forskolin doz-yanıt deneyi gösterilmektedir. FSK doz-yanıtı, sekiz saate kıyasla bir saatteki ortalama fraksiyonel değişimle karşılaştırılır, bu da sekiz saatlik tahlilin farklı FSK dozları arasında bir saattekilerden daha önemli bir şişme farkı üretebileceğini düşündürmektedir. Eğrinin altındaki alan, sekiz saatte ortalama fraksiyonel değişime kıyasla şişmede küçük bir fark gösterebilir.
Bu prosedürü denerken, toplama, sabitleme ve boyama işlemi sırasında organoidlerin kaybolacağını unutmayın. Bu nedenle, her adımda titizlikle dikkat edilmeli ve başarıyı sağlamak için yeterli başlangıç sayıları alınmalıdır. Kültür eklerinde büyüyen organoidler, bu teknikler geliştirildiği için bu konuda yardımcı olabilir.
Burada, diğer araştırmacılara genişlemeyi kolaylaştırmak için ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve malzemeleri kullandık. Ortak mikroskop teknikleri ve daha özel ekipman kullanan fonksiyonel bir tahlil de geliştirilmiştir.
