Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından Klinik Araştırma (IZKF) Münster Disiplinlerarası Merkezi (TOHUM 12/3, SB), (DFG) tarafından desteklenen, Hücreler-in-Motion Mükemmeliyet Kümesi (EXC 1003 - CIM), Muenster Üniversitesi (SB ve SGM kadar) ve Else Kröner-Fresenius-Stiftung (SB ve SGM için 2012_A88) tarafından. Biz mükemmel resimler için Heike Blum teşekkür ederiz.

Hayvan koruma Alman yasalarına göre ve yapılan tüm hayvan deneyleri yerel yönetimler (&quot;Recklinghausen, Almanya;; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW&quot;) tarafından kabul edildi. Fare Deneyleri 1. Genel Yorumlar <ol><li> İlgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneyler yapın. </li><li> Patojenden serbest durumlar altında farelerin tutmak ve yiyecek ve su ad libitum erişmesini sağlayacak. </li><li> Biyolojik özellikleri, yaş ve cinsiyete göre değişir, çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın. </li><li> Mümkün azaltmak rafine veya hayvan deneyleri değiştirmeye çalışın. </li></ol> Percoll 2. hazırlanması <ol><li> 1 mi 10x PBS, 1 mi FCS ve 10 ml Percoll 1x PBS 19 ml karıştırın. </li><li> Ste gerçekleştirinbir cam tüp içinde filtrasyonu (: 0.2 um filtre gözenek çapı) çözündürülür. Daha sonra 4 ° C&#39;de çözelti saklayın. </li></ol> Endotel hücre ortamı ve hücre kültür plakalarının Kaplamanın 3. hazırlanması <ol><li> Endotel hücre ortamı: <ol><li> 500 ml ortam hazırlanması: (. Yaklaşık% 20), 100 mi PDS ile 400 mi DMEM ortamı (. Yaklaşık% 80) karıştırın, 0.25 ml bFGF (. 20 ug / ml; yaklaşık% 0.05), 0.5 ml heparin (100 ul / mi;., yaklaşık% 0.1) ve 0.5 ml pyrumycin (4 mg / ml., yaklaşık% 0.1). Ancak kültür ilk 2 gün içinde kullanılan hücre kültür ortamı için pyrumycin ekleyin. </li><li> Bir cam tüp içinde bir steril süzme (: 0.2 um filtre gözenek çapı) yapın. Daha sonra 4 ° C&#39;de çözelti saklayın. </li></ol></li><li> Hücre kültür plakalarının Kaplama: <ol><li> Kaplama çözeltisi, 1 ml için, 500 ul GKD 2, O, 400 ul kolajen IV (0.4 mg / ml) ve 100 ul fibronektin (0.1 mg / ml) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li><li> EAC bütün yüzeyini kaplayacakkaplama solüsyonu ile hücre kültürü plakasının h yanı. Gece boyunca 4 ° C &#39;de plaka saklayın. </li></ol></li></ol> Fare Beyin mikrovasküler endotel hücreleri 4. izolasyonu (MBMEC) <ol><li> Servikal dislokasyon - (12 haftalık, C57BL / 6 8) 10 yetişkin fareler kurban. Daha sonra PBS 5 ml fare beyinleri ve mağaza izole (ihtar:! Çalışma steril). </li><li> Bir forseps ile beyin sapları, serebellası ve Thalami çıkarın. Dikkatlice steril bir kurutma kağıdı üzerine beyinleri yuvarlayarak meninksleri ayırın. Elde edilen Beyin zarı içermeyen forebrains toplayın. </li><li> DMEM 13.5 ml ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüpüne beyinleri aktarın. </li><li> Ortam sütlü hale gelene kadar, 10 ml&#39;lik bir pipet ile ilk önce, sonra 25 ml&#39;lik bir pipet ile, doku kıyma. </li><li> Daha sonra, bir yörünge üzerinde 37 ° C de 1 saat süre ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) &#39;de 0.6 ml kollajenaz CLS2 (10 mg / DMEM içerisinde mi) ve 0.2 ml DNAse (PBS içinde 1 mg / ml) içeren bir karışım ile doku özet sallamak180 rpm&#39;de r. </li><li> DMEM ekleme 10 mi, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de doku süspansiyon ve santrifüj hücreleri ilave edildi. </li><li> Atma süpernatant (İhtar:! PELLET kaybetmek kolaydır) </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de (yakl. 25 defa) (20 a / h%), ve santrifüj, miyelin kaldırmak BSA-DMEM, 25 ml, 25 ml&#39;lik bir pipet ile pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Büyük çaplı bir kırık cam Pasteur pipeti ile üst miyelin tabakasının (süt) atın ve daha sonra normal bir Pasteur pipeti ile BSA katman atılır. </li><li> 9 ml DMEM içinde pelletini ve 1 ml kolajenaz / dispaz ve 0.1 ml DNAse (nihai konsantrasyon 1 mg / ml) ilave edilmektedir. 180 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca çözeltinin Digest (uyarı: yeniden askıya almak için pipet - kullanmayın hücrelerin yok edilebilir). </li><li> Sindirim sırasında, ivme, wi ile, 4 ° C&#39;de 1 saat süre ile 3000 x g hızında bir ultrasantrifüj kullanarak, yoğunluk gradyanı ayarlamak için Percoll çözeltisi santrifüjthout fren. </li><li> Sindirilmiş hücre süspansiyonuna DMEM, 10 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. Daha sonra süpernatan atılır ve DMEM 2 ml pelletini. </li><li> Hızlanma ve fren olmadan 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 700 x g&#39;de Percoll gradient ve santrifüj üzerine dikkatli bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ekleyin. Not: Hücreler interfazda bir bulut gibi görünür. </li><li> Yaklaşık alın. Uzun bir steril bir iğne ile hücreleri ile ara faz 12 ml ve 5 ml DMEM ile yeni bir 50 ml&#39;lik Falcon yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1,000 x g hızında tekrar hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra endotel hücre ortamı içinde tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık kullanın. Ortamın 0.2 ml ve 1 cm hücre kültürü plakasının 2 yüzeyi başına). </li><li> Kaplanmış hücre kültür levhalarından Kaplama çözeltisini çıkarın (adım 3.2) ve iki ardışık yıkama aşamaları steril PBS ile de her yıkayın. </li><li> Endotelyal hücre kültürleri korumakHücre, 37 ° C&#39;de orta ve% 5 steril bir kuluçka makinesi içinde CO2. Her 2-3 gün orta değiştirin. % 90 izdiham Split hücreleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology.">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li><li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain;+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development.">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li><li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+(TREK1)+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS.">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li><li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging.">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li><li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li><li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li><li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-to-cell+junctions:+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis.">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+delivery.">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li><li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions.">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier.">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system.">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li><li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crawl,+cross:+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers.">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li><li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation.">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+NKG2D++T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation.">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455 (2013).</li><li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone.">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3,+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4.">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li><li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events.">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li><li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier.">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Kan beyin bariyeri disfonksiyon multipl skleroz BBB örneğin bir arıza yoğun Otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından MSS işgali kolaylaştırır ve oligodendrositlerin karşılaşma ve yıkımı sağlayan çeşitli zararlı MSS hastalıklarının bir işareti olur. Iskemik inme BBB bozulması ve beyin ödemi sonraki oluşumu ikincil enfarktüs büyüme ve hastaların 6 genel sağkalımı etkileyen önemli faktörlerdir. Ayrıca, uzak bölgelerde BBB değişimlerden fokal iskemik lezyonlar beyinde yaygın işlevsel değişikliklere neden edebiliyoruz. Ancak, altta yatan moleküler mekanizmaları 5 büyük ölçüde bilinmemektedir. Bunun aksine, fonksiyonel BMECs yüksek yoğunluğu ve akış taşıyıcıların çeşitlilik, enfeksiyöz hastalıklar için, beyin hastalıklar ya da antibiyotikler için kemoterapi maddeleri olarak yararlı ilaçların yoğunluğunu azaltır. Bu nedenle, kan-beyin-çubuğunun daha derin bir anlayışfizyolojik ve patofizyolojik koşullarda rier işlevi, özellikle tercih edilen bir yönünde 21 bariyer fonksiyonunu regüle edebilirler farmakolojik maddeler geliştirmek için gereklidir. BBB in vitro modellerinde Güvenilir BBB düzenleyici mekanizmaları incelemek için vazgeçilmez araçlardır. Birçok ölümsüzleştirilmiş beyin endotelyal hücre soyları kurulmuştur ve in vitro olarak BBB model 22 olarak da kullanılmıştır. Daha hızlı büyür ve birkaç pasaj üzerinde bazı BBB özelliklerini tutmak gibi bu hücre hatları birincil BMECs üzerinde bazı avantajlar sunuyoruz. Bununla birlikte, endotel hücre hatları tamamen in vivo durumu deneysel bulguların devredilebilirliği ile karışmasına gibi önemli özellikleri değiştirildiğinde birincil hücreler yerini alamaz. Örneğin, kemirgen beyin endotelyal hücre hattı bEnd.5 yüksek Parac neden kesikli olarak dağıtılmış sıkı birleşme proteinlerinin ancak düşük düzeylerde ekspreseellular geçirgenliği 23. BEnd.3, sıklıkla kullanılan bir diğer murin beyin endotelyal hücre hattı, yoğun ve sürekli dağıtılan sıkı kavşaklar, yüksek transendoteliyal direnci, çeşitli akış transporterlerini ve düşük paraselüler geçirgenlik gösterir. Birincil BMECs bazı hücre üzerinden ve paraselüler alt tabakaların 24 permeabilitesi ile ilgili gerçek bir ayrımı eksikliği Ancak bEND.3 hücre tabakaları karşılaştırıldı. Primer hücre kültürleri hazırlıklarında, bulaşıcı hücreler önemli ölçüde deneysel bulguların geçerliliği engelleyebilir. Endotel hücrelerinin yüksek saflık elde etmek için tarif edilen protokol, pyrumicin seçici bir madde olarak kullanılır. Bununla birlikte, hücre kültürünün, düzenli bir kalite kontrol kaçınılmaz olarak güvenilir deneyler için garanti etmek için gereklidir. Endotel hücrelerinin tipik morfolojik özellikleri (Şekil 1A bakınız), transendothelia yanı sıra kalite kontrolü için çeşitli yöntemler vardırl direncinin ölçülmesi olabilir ya da bu tür CD31 gibi endotel hücre markeri ekspresyonu (Şekil 1B&#39;ye bakınız) ya da, von Willebrand faktörü (vWF) ile değerlendirilebilir. Bir fare beyninden izole edilmiş beyin endotelyal hücrelerin sayısı göreceli olarak düşüktür ve çok sayıda deney için uygun bir hücre kültürünün ayarlamak için birkaç farelerin beyinleri toplanmış gerekir. Deneyimlerimize göre, en az 10 farenin ilgili hayvan tesisine kaynaklarına bağlı olarak sınırlayıcı bir faktör olabilir, bir deney için kullanılması gerekmektedir. Bias ve eşlik eden faktörler önlemek için, benzer bir genetik ve çevresel kökenli fareler sadece bir araya getirilmiş olması gerekir. Bunun tersine, sığır ve domuz beyin endotelyal hücre preparatları, bir beyin bölgesindeki uygun beyin endotelyal hücrelerin geniş bir dizi sağlar. Bununla birlikte, karmaşık olmayan bir üretim ve barındırma, mevcut transgenik farelerin, geniş ve artan repertuarına yanında birincil sıçangil BMECs ideal olarak işlemekmodeli, kan-beyin bariyeri işlevini incelemek için. BBB ve altta yatan moleküler mekanizmaların işlevleri hakkında birkaç önemli bulgular 2D doku kültürü sistemlerinde çalışmalardan gelir. Son zamanlarda, 3D kültür sistemleri endotel hücreleri lümeni ve boru şekilli ağlar oluşturmak üzere sağlayarak bir kollajen matrisi içine yerleştirilen 25, geliştirilmiştir. Bu yeni hücre kültür sistemleri, in vivo olarak da faal organizma üzerindeki vasküler süreçlerin daha da hassas üretimi için izin verir. Böyle perisitlere ve astrositleri NVU 3D hücre kültürü sistemlerinin daha hücrelerin katılımı kan-beyin-bariyer fonksiyonunun okuyan in vitro devrim olabilir; İlk modelleri son 26 geliştirilmiştir. Sorun giderme için bazı öneriler vardır. Tüm steril çalışma önce endotel hücre kültürünün kalitesi için gereklidir. İkinci olarak, pyrumycin sadece hücre eklenmelidirKültürün ilk 2 gün içinde kullanılan kültür ortamı, uzun uygulama artan MBMEC hücre ölümü ve düşük kaliteli bir bariyer fonksiyonunun neden olabilir. Üçüncü olarak, bu protokolde uygulanan enzimler üretici firmanın talimatlarına uygun olarak kullanılmış ve muhafaza edilmelidir; aksi takdirde düzgün işlevi bozulabilir. Endotel hücreleri EKLEMEYİNİZ Dahası, hücre kültür plakalarının kaplama değişiklik olabilir. Fibronektin ve kollajen konsantrasyonları değiştirilebilir olabilir veya başka bir matris proteinleri, kaplama çözeltisine eklenebilir. Son olarak, yaş, cinsiyet, hayvan tesis içinde yıl ve çevre koşullarının sezon MBMEC izolasyonu ve deneyler karşılaştırılabilirlik kalitesini etkileyebilecek önemli faktörlerdir. Bu koşullar, bağımsız deneyler arasında karşılaştırılabilir olması sağlanmalıdır. Açıklanan protokol, sıçangil BMECs izole etmek için temel bir nöroimmünolojik yöntem olarak kabul edilmelidir. Izole edilmiş hücreler olabilir, uBu tür göç deneyleri, gen ve protein ifade çalışmaları, elektrofizyolojik değerlendirmeler veya geçirgenlik deneyleri gibi BBB fonksiyonu içine daha fazla fikir, kazanmak için geniş bir uygulama yelpazesi için sed. Yukarıda zikredildiği gibi, BMECs 3D hücre kültür sistemleri Nvu bağlamında bbb düzenlenmesinde rol oynayan karmaşık mekanizmalarını incelemek için yeni fırsatlar sağlayabilir. Bu nedenle, primer endotel hücrelerinin izolasyonu gelecek BBB araştırma alanında çok değerli bir teknik kalacaktır.

<html> Son derece uzmanlaşmış, kan-beyin-bariyerinin (KBB) ayrılmaz bir parçası olan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC) form monotabaka. BMECs bir bazal membran bağlı birleşim proteinler tarafından birbirine bağlanır. Birlikte perisitlerin, düz kas hücreleri, astrositik son ayak ve dolaşımdaki kan hücreleri ile bu sözde nörovasküler ünitesi (Nvu) 1 oluşturmak. Kan ve merkezi sinir sistemi (MSS) arasında su geçirmez bir bariyer önceki fikrine karşı, NVU serebral kan damarları ve merkezi sinir sistemi 2 ile sıvı, moleküller ve hücrelerin geçişini kontrol eden bir dinamik, son derece spesifik ve düzenli bir arayüz . Nvu bir fonksiyon bozukluğu ya da düzensizliği, başlatma ve / veya mesela iskemik inme, HİV-ensefalopati, multipl skleroz, Alzheimer ya da Parkinson hastalığı 3-6 gibi merkezi sinir sisteminin nörovasküler, enfeksiyöz enflamatuar veya dejeneratif hastalıkların, çeşitli katkıda bulunabilir. _content &quot;&gt; BMEC tek tabaka sıkıca sıkı (TJ) oluştuğu bir kavşak kompleksi tarafından mühürlenir ve (AJ) 7., yüksek elektrik direnci ve BBB düşük paraselüler geçirgenlik ağırlıklı TJ proteinler dayanmaktadır kavşakları 8. TJs vardır adherens örneğin zonulaoccludens (zo) proteinleri olarak adaptör moleküller, endotel hücrelerinin hücre iskeleti ile bağlantılıdır Claudin ve occludin ailesinin zar proteinleri, oluşan kompleksler ZO1-3 4 adherens birleşme esas olarak bütün zar proteini tarafından monte edilir. kateninlerin 8 yoluyla hücre iskeleti ile bağlantılı vasküler endotelyal (VE) -cadherin. BBB sıkı sızdırmazlık kan ve BOS arasında yüzeylerde ve hücrelerin serbest değişimini engeller. Bu kuralın istisnaları lipid-aracılı difüzyon 9 tarafından BBB geçmeye edebiliyoruz bir molekül ağırlığı &lt;400 Da ile lipofilik, küçük moleküllerdir. Geçişi, daha büyük ve / veyaörneğin glükoz, amino asitler, peptidler, proteinler ve bazı ilaçlar gibi hidrofil olan moleküller, beş ana sınıfa ayrılabilir yüksek oranda kontrol edilen hücre üzerinden taşıma sistemleri 10, sınırlı: taşıyıcı aracılı taşıma, iyon taşıma, aktif akış ulaşım, reseptör aracılı ulaşım ve kaveolanın aracılı taşıma 4. Bu taşıyıcı sistemleri, bir doğru sinyal üretimi, transdüksiyon ve entegrasyon için gerekli olan merkezi sinir sistemi, dengesini sağlamaya yardımcı olur. Ayrıca, BMECs aktif ectoenzymes çeşitli ifadesi ile ayrı moleküllerin geçişini kontrol etmek mümkün bulunmaktadır. Bu enzimler, engelleyici ya da BBB 11 geçişini sağlayan belirli bir iç ve dış alt tabakalar, hücre yüzeyinde lokalize ve değiştirmesi. CNS uzun bir süre için bir bağışıklık ayrıcalıklı bir organ olarak kabul edildi ise, son bulgular bağışıklık Surv bir oldukça dinamik ve sıkı düzenlenmiş sistemini önermekMSS&#39;nin eillance. BMECs eleştirel bağışıklık hücre göçü düzenlenmesinde rol. Yüzey lenfositler üzerinde selektinler sentezlenmesi ile seçici olarak gevşek endotelyuma bağlamak için indüklenir. Lökositler üzerinde belirli reseptörler ile karşılaşma kemokinlerin salgılanması ekspresyonu ya da LFA-1 gibi lökosit bütünleyicilerinin konformasyonel değişikliklere neden olmaktadır (limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen-1) ve VLA-4 (çok geç antijen-4). Integrinleri arasında ya BBB 12-14 BMECs ile beyin parankiması içine transmigrasyonu sağlayan endotel counterreceptors, örneğin, VCAM-l (damar hücresi yapışma molekülü), ICAM-I, (hücreler arası adhezyon molekülü) bağlanma ile sıkı bir yapışmaya aracılık eder. Bunlar ve diğer bulgular, bağışıklık hücre göçünü düzenlenmesinde endotel kendisinin aktif rolünü göstermektedir. Ayrıca, BMECs Nvu parçası serebral kan akımı li düzenlenmesinde rol gibidiryerel nöronal metabolik talepleri nked. Astrositik uyarımı üzerine, endotel hücreleri, vasküler düz kas hücreleri 15 gevşemesine neden olan nitrik oksit gibi vazoaktif maddeler üretmektedir. Gelişmekte yanı sıra yetişkin beyin gösteri paralel desenleme ve geliştirme ve düzenleme 1, 4, birçok özelliklerini paylaşmak Anjiyogenesis ve nöron. Endotel hücreleri kritik Bu işlemler 16, 17 yer alırlar. Özetle, BMECs MSS uygun bir geliştirme ve işleyişini garanti için gerekli özellikleri sağlar. BBB fonksiyon bozukluğu pek çok ciddi nörolojik bozukluklara bağlıdır. Bununla birlikte, çok az hedef spesifik ve etkili tedavi 18 beyin-damar sistemi ara yüzeyinde tespit edilmiştir. In vitro modellerinin basitleştirilmiş bir lo için fonksiyonu ve karmaşık fizyolojik sistemlerin düzenlenmesinde rol mekanizmaları anlamak için kullanılmıştırng zamanı. Bu yazıda ve murin BMECs in vitro çalışmada tarif edilen özel fare nakavt-suşların çeşitli verilen izolasyon, yeni tedavi edici kapılar açmaktadır fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda KBB fonksiyonu ve düzenleme daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Hemen olarak izolasyon işleminden sonra, kemirgen BMECs ve bulaşıcı hücreler, hücre kültür ortamı (Şekil 1 A, 0 gün) içinde yüzen konglomera oluşturur. Bu tür toksinler için göreli bir dirence yol açan, P-glikoprotein olarak akış taşıyıcıların yüksek seviyelerde ifade ettiklerinden pyrumycin ile muamele sıçangil BMECs bir seçimine neden olur. Kirlenmesine neden olan hücreleri aracılı sitotoksisite 19 pyrumycin çok daha hassastır. MBMECs kolajen IV / fibronektin kaplı hücre kültürü plakaları (Şekil 1A, Gün 1 ve Gün 2) takmak için başlar ise pyrumicin seçim sürecinde, bulaşıcı hücreler, apoptotik ya da nekrotik hücre ölümü girin. 5 gün kadar, MBMECs, yaklaşık bir yoğunluğa çoğalır. 80-90%. Bunlar tipik iğ şekilli bir görünüm ile karakterize edilir. Konflüansta, sıkıca uzunlamasına hizalanmış, paketlenmiş olan ve olmayan üst üste binen temas inhibe hücreleri (Şekil 1A, gün 5) bir tek tabaka oluşturur. Tarafından(Şekil 1B PECAM1) endotelyal hücre belirteci, CD31 ile gösterildiği gibi pyrumicin seçimi,% 99&#39;a kadar MBMEC bir yüksek saflıkta ulaşılır. MBMECs sıkı sıkı birleşme proteinleri tarafından birbirine bağlanmış, kapalı tek katmanlarını oluştururlar. 7. Sonra - Kültür 8 gün, endotel hücre elektrik direnci için sabit değerler oluşturmak (20 arasındaki tipik değerlere ulaşır - Ω 30 x cm2). Ve kondansatör (Şekil 1C) bu zaman noktasında fonksiyonel deneyler, bu hücre-gibi Evans mavi ya da dekstran, örneğin geçiş Deneyler 3, 20,21 ve geçirgenlik testi, yapılmalıdır. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Morfolojik ve faregiller BMECs fonksiyonel özellikleri. Transmisyon ışık mikro tarafından izlendi kültürlü BMECs (A) Temsilcisi zaman dersüzerinde 5 gün skopi. Skala çubuğu bütün resimler için de geçerlidir. Endotelyal hücre belirteci CD31 (B), immünofloresan boyama gün 5 CD31 (yeşil) ve DAPI (mavi) de. (C), hücreler, 5 gün süreyle önceden kültürlenmiş ve daha sonra otomatik bir sisteme aktarıldı biyofiziksel özellikleri (direnç ve kondansatör) analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K Görüntüleme.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Video: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.