Burada hayvan dokularındaki Heme olmayan içerikleri ölçmek için bir protokol sağladık. Çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen, iyi kurulmuş basit bir kolorimetrik tahlil kullanarak. Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil, sofistike beceriler veya oldukça pahalı ekipman gerektirmez ve daha yüksek numune verimi ve maliyet etkinliği için mikroplaka formatına uyarlanabilir.
Bu protokol, aşırı demir yükü veya demir verimliliği ile ilgili çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için uygundur. 10 ila 100 gram ağırlığındaki bir doku örneğini neşter bıçağı ile keserek başlayın. Analitik terazide küçük bir parafilm parçası üzerinde doğru şekilde tartın.
Doku parçasını 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirmek için plastik cımbız kullanın. Standart bir inkübatörde 65 santigrat derecede 48 saat kurumaya bırakın. Alternatif olarak, çubuk cımbız kullanarak wade doku parçasını demirsiz bir Teflon bardağa yerleştirin ve laboratuvar mikrodalga sindirim fırınında kurutun.
Her kurumuş doku parçasını analitik terazinin içindeki küçük bir paraform parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın. Her kurutulmuş doku parçasını 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe asit karışımının bir ışığını ekleyin ve kapatın.
Dokunun burada ihmal edilmesi dışında aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın. Dokuyu sindirmek için tüpleri 20 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 500 mikrolitre şeffaf asit ekstraktını yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarmak için plastik uçlarla donatılmış bir mikro pipet kullanın.
Kromojen reaksiyonlarını doğrudan düz tabanlı 96 kuyucuklu, berrak işlenmemiş polistiren mikro plakalara hazırlayın. 15 dakika boyunca inkübe edilmiş oda sıcaklığı. Bir plaka okuyucudaki numune emiciliğini, deiyonize su referansına karşı 535 nano metre dalga boyunda ölçün.
Küvet ile heme olmayan demirin tayini ve 96 delikli mikroplaka esaslı kolorimetrik tahliller burada gösterilmiştir. Altı aylık erkek siyah, karaciğer, dalak, kalp, akciğer ve kemik iliği dahil olmak üzere altı fareden alınan 55 doku örneğinde küvet bazlı ve mikro plaka bazlı heme olmayan demir seviyeleri arasındaki korelasyon burada gösterilmiştir. İki metodoloji arasındaki yüksek korelasyon, mikro plaka bazlı yöntemin orijinal küvet bazlı yönteme geçerli bir alternatif olduğunu göstermektedir.
Son olarak, heme olmayan demir seviyeleri, aynı dokulardan elde edilen numunenin hidroklorik asit ve trikloroasetik asit veya hidroklorik asit karışımı ile asidik sindiriminden sonra mikro plaka bazlı yöntemle ölçülmüştür. Yüksek korelasyon, trikloroasetik asidin asit sindiriminden yayılabileceğini göstermektedir. Temsili görüntü, Bathophenanthroline Based Colorimetric Testi ile ölçülen siyah altı genetik arka plan üzerinde erkek siyah altı vahşi tip farenin ve erkek hepcidin nakavt farelerinin karaciğer, dalak, kalp ve pankreasındaki heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir.
Hepcidinin bozulması, şiddetli hepatik, pankreas ve kardiyak demir birikimi ve dalak demir tükenmesi ile demir birikimi fenotipi gibi hemokromatoza yol açar. Deneysel demir modülasyonunu takiben genç dişi Avrupa levreklerinde hepatik heme olmayan demir seviyeleri burada gösterilmiştir. Hepatik demir seviyeleri, demir ile muamele edilen hayvanlarda büyük ölçüde artmıştır.
Oysa anemi hepatik demir depolarında hafif bir azalmaya neden oldu. Temsili görüntüler, bir aylık Drosophila'da Bathophenanthroline Bazlı Kolorimetrik Tahlil ile ölçülen heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir. Sonuçlar, 20 sineğin her havuzundaki heme olmayan demir içeriğini veya her bir sineğin tahmini demir içeriğini göstermektedir.
Sinek başına ortalama 0.64 miligram ağırlık göz önüne alındığında. Bu prosedürü denerken tüm cam aşınmasını iyice temizlemeyi unutmayın ve kontaminasyon riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin.
