Здесь мы предоставили протокол для измерения негемового содержания в тканях животных. Использование простого хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который может быть легко реализован в большинстве лабораторий. Колориметрический анализ на основе батофенантролина не требует сложных навыков или дорогостоящего оборудования и может быть адаптирован к формату микропластин для более высокой пропускной способности образца и экономической эффективности.
Этот протокол подходит для обнаружения изменений в уровнях железа в тканях в различных экспериментальных моделях перегрузки железа на животных или эффективности железа. Начните с разрезания образца ткани весом от 10 до 100 граммов лезвием скальпеля. Точно взвесьте его в аналитических весах над небольшим кусочком парапленки.
Используйте пластиковый пинцет, чтобы поместить кусок ткани в 24-луночную пластину. Дайте ему высохнуть на стандартном инкубаторе при 65 градусах Цельсия в течение 48 часов. В качестве альтернативы поместите кусочек салфетки с помощью пинцета в безжелезненную тефлоновую чашку и высушите ее в лабораторной микроволновой печи для сбраживания.
Поместите каждый высушенный кусочек ткани на небольшой кусочек параформы внутри аналитических весов и точно взвесьте его. Переложите каждый высушенный кусочек ткани в микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра. Добавьте в трубку литую кислотную смесь и закройте ее.
Приготовьте кислотную заготовку таким же образом, за исключением того, что ткань здесь опущена. Инкубируйте трубки при температуре 65 градусов цельсия в течение 20 часов, чтобы переварить ткань. После охлаждения до комнатной температуры используйте микропипетку, оснащенную пластиковыми наконечниками, для переноса 500 микролитров прозрачного кислотного экстракта в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Подготавливают хромогенные реакции непосредственно в плоское дно 96-луночных, прозрачных необработанных полистирольных микропластин. Инкубируют комнатной температуры в течение 15 минут. Измерьте поглощение образца в пластинчатом считывателе на длине волны 535 нанометров по отношению к деионизированному эталону воды.
Здесь показано определение негемового железа с помощью кюветы и колориметрических анализов на основе 96-луночных микропластин. Здесь показана корреляция между уровнями негемового железа на основе кюветы и микропластинки в 55 образцах тканей шестимесячных самцов черного, шести мышей, включая печень, селезенку, сердце, легкие и костный мозг. Высокая корреляция между двумя методологиями указывает на то, что метод на основе микропластин является действительной альтернативой оригинальному методу на основе кюветы.
Наконец, уровни негемового железа были количественно определены методом на основе микропластинчат после кислотного переваривания образца, полученного из тех же тканей либо смесью соляной кислоты и трихлоруксусной кислоты, либо только соляной кислотой. Высокая корреляция показывает, что трихлоруксусная кислота может выделяться из кислотного пищеварения. Репрезентативное изображение показывает уровни негемового железа в печени, селезенке, сердце и поджелудочной железе самцов черных шести мышей дикого типа и самцов нокаутирующих мышей гепцидина на черном шести генетическом фоне, измеренном с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина.
Нарушение гепцидина приводит к гемохроматозу, подобному фенотипу отложения железа с тяжелым накоплением железа в печени, поджелудочной железе и сердцем и истощением селезеночного железа. Здесь показаны уровни печеночного негемового железа у молодых самок европейского морского окуня после экспериментальной модуляции железа. Уровень железа в печени значительно увеличился у животных, получавших железо.
В то время как анемия вызывала умеренное снижение запасов печеночного железа. Репрезентативные изображения показывают уровни негемового железа у месячной дрозофилы, измеренные с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина. Результаты показывают содержание негемового железа в каждом бассейне из 20 мух или предполагаемое содержание железа в каждой мухе.
Учитывая средний вес 0,64 миллиграмма на муху. При попытке этой процедуры не забудьте тщательно очистить весь износ стекла и не позволяйте металлическим лабораторным материалам вступать в контакт с каким-либо реагентом или раствором из-за риска загрязнения.
