Qui abbiamo fornito un protocollo per misurare il contenuto non-Heme nei tessuti animali. Utilizzando un semplice saggio colorimetrico ben consolidato che può essere implementato facilmente nella maggior parte dei laboratori. Il test colorimetrico basato su bathofenantrolina non richiede competenze sofisticate o attrezzature molto costose e può essere adattato al formato micropiastra per una maggiore produttività del campione e un'efficacia dei costi.
Questo protocollo è adatto per rilevare alterazioni nei livelli di ferro nei tessuti in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarichi di ferro o efficienza del ferro. Inizia tagliando un campione di tessuto del peso di 10-100 grammi con una lama di bisturi. Pesarlo accuratamente in una bilancia analitica su un piccolo pezzo di parafilm.
Utilizzare pinzette di plastica per posizionare il pezzo di tessuto in una piastra a 24 pozzetti. Lasciare asciugare su un'incubatrice standard a 65 gradi Celsius per 48 ore. In alternativa, posizionare il pezzo di tessuto con una pinzetta a bastoncino in una tazza di Teflon senza ferro e asciugarlo nel forno di digestione a microonde di laboratorio.
Posizionare ogni pezzo di tessuto essiccato su un piccolo pezzo di paraforma all'interno di una bilancia analitica e pesarlo accuratamente. Trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in un tubo micro centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un lit della miscela acida al tubo e chiuderlo.
Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso qui. Incubare i tubi a 65 gradi Celsius per 20 ore per digerire il tessuto. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente utilizzare una micro pipetta dotata di punte di plastica per trasferire 500 microlitri dell'estratto di acido chiaro in un nuovo tubo micro centrifuga da 1,5 millilitri.
Preparare le reazioni cromogene direttamente nelle micro piastre di polistirene trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti non trattate. Temperatura ambiente incubata per 15 minuti. Misurare l'assorbanza del campione in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nanometri rispetto a un riferimento di acqua deionizzata.
La determinazione del ferro non eme mediante i saggi colorimetrici basati su cuvetta e micropiastre a 96 pozzetti sono mostrati qui. La correlazione tra i livelli di ferro non eme a base di cuvette e micropiastre in 55 campioni di tessuto di maschio nero di sei mesi, sei topi, tra cui fegato, milza, cuore, polmoni e midollo osseo sono mostrati qui. L'elevata correlazione tra le due metodologie indica che il metodo basato su micropiastre è una valida alternativa al metodo originale basato su cuvette.
Infine, i livelli di ferro non eme sono stati quantificati con il metodo basato su micropiastre dopo la digestione acida di campioni derivati dagli stessi tessuti con una miscela di acido cloridrico e acido tricloroacetico o acido cloridrico da solo. L'alta correlazione mostra che l'acido tricloroacetico può essere emesso dalla digestione acida. L'immagine rappresentativa mostra i livelli di ferro non eme nel fegato, nella milza, nel cuore e nel pancreas di sei topi maschi neri di tipo selvatico e topi knockout di epcidina maschi su fondo genetico nero sei misurati con il test colorimetrico basato su Bathophenanthroline.
L'interruzione dell'epcidina porta a un fenotipo di emocromatosi come la deposizione di ferro con grave accumulo di ferro epatico, pancreatico e cardiaco e deplezione di ferro splenico. I livelli epatici di ferro non eme nella spigola europea femminile giovanile a seguito di modulazione sperimentale del ferro sono mostrati qui. I livelli di ferro epatico sono aumentati in modo massiccio negli animali trattati con ferro.
Mentre l'anemia ha causato una lieve riduzione delle riserve epatiche di ferro. Le immagini rappresentative mostrano i livelli di ferro non eme nella Drosophila di un mese misurati con un test colorimetrico basato su Bathophenanthroline. I risultati mostrano il contenuto di ferro non eme in ogni pool di 20 mosche o il contenuto di ferro stimato di ogni mosca.
Considerando un peso medio di 0,64 milligrammi per mosca. Durante il tentativo di questa procedura ricordarsi di pulire a fondo tutta l'usura del vetro e non permettere ai materiali metallici di laboratorio di entrare in contatto con alcun reagente o soluzione a causa del rischio di contaminazione.
