Aqui fornecemos um protocolo para medir o conteúdo não-Heme em tecidos animais. Usando um simples estonteante assimétrico colorido que pode ser implementado facilmente na maioria dos laboratórios. O ensaio Colorimétrico Baseado em Bathophenanthroline não requer habilidades sofisticadas ou equipamentos altamente caros e pode ser adaptado ao formato de microplape para maior rendimento amostral e custo-benefício.
Este protocolo é adequado para detectar alterações nos níveis de ferro tecidual em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecargas de ferro ou eficiência de ferro. Comece cortando uma amostra de tecido pesando de 10 a 100 gramas com uma lâmina de bisturi. Pese-o com precisão em um equilíbrio analítico sobre um pequeno pedaço de parafilm.
Use pinças plásticas para colocar o pedaço de tecido em uma placa de 24 poços. Deixe-o secar em uma incubadora padrão a 65 graus celsius por 48 horas. Alternativamente, coloque o pedaço de tecido de wade usando pinças de vara em um copo de Teflon sem ferro e seque-o no forno de digestão de micro-ondas de laboratório.
Coloque cada pedaço seco de tecido sobre um pequeno pedaço de paraforme dentro de um equilíbrio analítico e pese-o com precisão. Transfira cada pedaço seco de tecido em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Adicione uma luz da mistura de ácido ao tubo e feche-a.
Prepare um ácido em branco da mesma forma, exceto que o tecido é omitido aqui. Incubar os tubos a 65 graus celsius por 20 horas para digerir o tecido. Depois de esfriar à temperatura ambiente use uma micro pipeta equipada com pontas plásticas para transferir 500 microliters do extrato de ácido claro para um novo tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro.
Prepare reações cromogenas diretamente no fundo plano 96-bem, claramente sem tratamento micro placas de poliestireno. Temperatura ambiente incubada por 15 minutos. Meça a absorvância da amostra em um leitor de placas a um comprimento de onda de 535 nano metros contra uma referência de água deionizada.
A determinação do ferro não-heme pelo cuvette e 96 poços de assins coloridos à base de microplatos são mostrados aqui. A correlação entre a base de cuvette e os níveis de ferro não-heme baseados em 55 amostras de tecido de seis meses de idade, preto masculino, seis camundongos, incluindo fígado, baço, coração, pulmões e medula óssea são mostrados aqui. A alta correlação entre as duas metodologias indica que o método baseado em micro placa é uma alternativa válida ao método original baseado em cuvette.
Finalmente, os níveis de ferro não heme foram quantificados com o método à base de micro placa após digestão ácida da amostra derivada dos mesmos tecidos com uma mistura de ácido clorídrico e ácido tricloroacético ou ácido clorídrico sozinho. A alta correlação mostra que o ácido tricloroacético pode ser emitido a partir da digestão ácida. A imagem representativa mostra os níveis de ferro não-heme no fígado, baço, coração e pâncreas de machos negros seis ratos selvagens e camundongos machos hepcidin knockout em seis fundos genéticos pretos medidos com Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay.
A interrupção da hepcidina leva a uma hemocromatose como fenotipo de deposição de ferro com acúmulo severo de ferro agitado, pancreático e cardíaco e esgotamento de ferro esplênico. Os níveis de ferro hepáticos não-heme em robalos europeus femininos juvenis após a modulação experimental de ferro são mostrados aqui. Os níveis de ferro hepático aumentaram maciçamente em animais tratados com ferro.
Considerando que a anemia causou uma leve redução nas lojas de ferro hepática. As imagens representativas mostram os níveis de ferro não heme em Drosophila de um mês de idade medido com um ensaio colorimétrico baseado em bathophenanthroline. Os resultados mostram o teor de ferro não-heme em cada pool de 20 moscas ou o teor de ferro estimado de cada mosca.
Considerando um peso médio de 0,64 miligramas por mosca. Ao tentar este procedimento lembre-se de limpar completamente todo o desgaste do vidro e não permita que os materiais de laboratório metálicos entrem em contato com qualquer reagente ou solução devido ao risco de contaminação.
