Demir biyoyararlanımı bilgisi, gıdalardaki demirin beslenme kalitesinin değerlendirilmesi için esastır. Caco-2 hücre biyotahlili, bu kritik araştırma ihtiyacını karşılamak için geliştirilmiştir. Bu biyotahlil, farklı diyetlerden demir biyoyararlanımını belirlemek için uygun maliyetli ve yüksek verimli bir yaklaşımdır.
Demir biyoyararlanımını etkileyen faktörleri karakterize etmek ve in vivo çalışma hedeflerini rafine etmek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma teknisyeni olan Yongpei Chang olacak. Başlamak için, Caco-2 hücrelerini 7 ila 10 gün boyunca kültürleyin ve yeterli hücre mevcut olduğunda, hücreleri kollajen kaplı olmayan bir şişede tohumlayın.
Daha sonra şişelerdeki hücreleri yedi gün boyunca büyütün ve alternatif bir günde ortamı değiştirin. Yedinci günde, çok kuyulu plakaları tohumlamak için hücreleri kullanın. Caco-2 hücrelerini, santimetre kare başına 50.000 hücre yoğunluğunda, altı iyi kollajen kaplı plakada tohumlayın.
Plakalara HEPES, FBS ve% 1 antibiyotik antimikotik solüsyon ile desteklenmiş DMEM ekleyin. Daha sonra% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 12 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Tutarlı bir günlük programda ortamı en az iki günde bir değiştirmeye devam edin.
Daha sonra borular, antibiyotik antimikotik çözelti, hidrokortizon, insülin, selenyum, triiodotironin ve epidermal büyüme faktörü ile desteklenmiş minimum esansiyel ortam hazırlayın. Kültür ortamını, hazırlanan bu ortamın iki mililitresi ile değiştirin. Ertesi gün, pH 7'de minimum esansiyel ortamın bir mililitresi ile değiştirin.
Şimdi asitle yıkanmış diyaliz membranı ile donatılmış silikon bir O-ring kullanarak sterilize edilmiş bir kesici uç halkası oluşturun. 13. günde, ekleri buzdolabından çıkarın, boşaltın ve suyu 0,5 molar hidroklorik asit ile değiştirin. Kullanmadan önce laminer akışlı bir davlumbazda en az bir saat bekletin.
Daha sonra 0.5 molar hidroklorik asidi boşaltın ve steril 18 megaohm su ile durulayın. Kullanıma hazır olana kadar steril 18 megaohm suda laminer bir davlumbazda saklayın. Altı kuyu plakasının hücrelerini içeren kuyucuklara bir halka yerleştirerek iki odacıklı bir sistem oluşturun ve ardından plakayı eklerle birlikte inkübatöre geri gönderin.
Pankreatin-safra çözeltisini hazırlamak için, çözünür pankreatin ve safra ekstraktına 87.5 gram zayıf katyon değişim reçinesi ekleyin ve bileşenleri karıştırmak için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı kullanın. Bulamacı büyük bir sütuna dökün ve sütunu boşaltın. Sonra sütun eluentini santrifüj edin.
Numuneyi steril 50 mililitrelik santrifüj tüpünde tartın. Hidroklorik asit kullanarak pH'ı ayarlayın ve 140 milimolar sodyum klorür ve beş milimolar potasyum klorür içeren 10 mililitre fizyolojik salin ekleyin. Ardından, hazırlanan domuz pepsin çözeltisinin 0,5 mililitresini numuneye ekleyerek gastrik sindirim işlemini ayarlayın.
Daha sonra sallanan bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede bir saat boyunca yumuşak bir ayarda inkübe edin ve pH'ı 1.0 molar sodyum bikarbonat ile 5.5 ila 6.0'a ayarlayarak her numunenin bağırsak sindirim işlemini başlatın. Her numune tüpüne 2,5 mililitre pankreatin safra çözeltisi ekleyin ve 1,0 molar sodyum bikarbonat ile pH'ı 6,9 ila 7,0 arasında ayarlayın. 140 milimolar sodyum klorür ve beş milimolar potasyum klorür içeren çözeltiyi kullanarak, her tüp tam olarak 15 gram toplam malzeme içerecek şekilde sıvılar ekleyin.
Şimdi her bağırsak sindiriminin 1,5 mililitresini, altı kuyu kültür plakasının Caco-2 hücrelerini içeren kuyunun üst odasına aktarın. Plaka kapağını değiştirin ve iki saat boyunca dakikada altı salınımda sallanan bir çalkalayıcıda% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Kesici uç halkasını özet ile çıkarın.
Daha sonra her bir oyuğa pH 7'de bir mililitre minimum esansiyel ortam ekleyin ve plakayı 22 saat boyunca inkübatörde tekrar tutun. Şimdi hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre mono tabakasına iki mililitre 18 megaohm su ekleyin. Bir sonikatöre aktarın ve hücre proteini ve hücre ferritin analizleri için tüm hücre lizatını mikro santrifüj tüplerine toplayın.
Manteca çeşitleri, art arda iki hasat yılı boyunca beyaz ve kırmızı modellenmiş renk sınıflarının referans kontrollerine göre daha yüksek demir mevcudiyeti göstermiştir. Beyaz ve sarı fasulye çeşitlerinden elde edilen demir biyoyararlanımı, un haline getirildikten sonra bir artış göstermiştir. Bununla birlikte, demir biyoyararlanımı kızılcık, kırmızı böbrek ve siyah çeşitlerinde bir azalma göstermiştir.
Bu biyotahlilin başarılı kullanımı için uygun Kako-2 hücre tek katmanlı kültürleme şarttır. Büyüme ve bakımın ayrıntılarına tam olarak dikkat edilmesi, biyotahlilin tutarlı yanıtının anahtarıdır. Bu model, diğer yaklaşımların dezavantajlarını ve yüksek maliyetini reddeder ve araştırmacıların mekanizmaları tanımlamalarını ve demir biyoyararlanımını inhibe eden ve teşvik eden faktörleri daha iyi değerlendirmelerini sağlar.
