MycoPatt yöntemi, köklerde arbusküler mikorizal kolonizasyonun derinlemesine araştırılmasına izin verir. Mikorizal haritalar mantar genişlemesine işaret eder ve her yapının gerçek konumunu belirli bir desen olarak sunar. Mikorizal kolonizasyon objektif olarak %1 çözünürlükte analiz edilir.
Her kök segment otomatik olarak dijital matrise dönüştürülür ve kolonizasyon parametrelerinin kapsamlı bir veritabanını oluşturur. Başlamak için, kökleri buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmesi için bir çalışma platformuna yerleştirin. Kök temizliği yapmak için, bir bitkideki tüm kökleri 30 ila 50 mililitrelik bir kavanoza yerleştirin, ardından musluk suyuyla% 10'luk bir sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın ve kökleri tamamen kaplayana kadar kavanoza dökün.
Temizleme çözeltisinin köklerde homojen bir şekilde dağılması için kavanozu bir ila iki dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Köklerin temizleme çözeltisinde 48 saat kalmasına izin verin. Kök durulama için, kavanozun içeriğini bir elek içinden geçirin.
Temizleme çözeltisi tamamen çıkarılana kadar kökleri musluk suyunda birkaç kez durulayın. Daha sonra durulanmış kökleri lekeleme için temiz bir kavanoza yerleştirin. Daha sonra musluk suyuyla yüzde beş ila beş mürekkep sirkesi çözeltisi hazırlayın.
Kökleri örtene kadar kavanoza dökün ve bir ila iki dakika çalkalayın. Kısmi destaining için 48 saat sonra, lekeli kökleri musluk suyunda bir ila iki dakika durulayın. Ekstra lekelenme solüsyonunu çıkarmak için kavanozu kuvvetlice sallayın.
Mikroskobik değerlendirme için kökler temizlenene kadar prosedürü tekrarlayın. Kök segmentasyonu için, lekeli kökleri ölçekli bir kesme tahtasına yerleştirin. Kökleri bir santimetre segmente ayırın.
Her varyasyon için 15 segment seçin. Daha sonra, kökleri segment hazırlığı için bir slayta yayın, kökleri örtmek için bir laminasyon torbası kullanın ve bir kenardan başlayarak yavaşça ezin. Slayttaki kökleri görüntülemek için yumuşak plastik bir alet kullanın.
Laminasyon torbasını dikkatlice çıkarın ve numuneyi bir kapak kayması ile örtün. Slaytın bir köşesine pipetle su ekleyin ve suyun yavaşça kaydırağa yayılmasına izin verin. Ekstra suyu bir kağıt havluyla çıkarın.
Mikroskobik analiz için, iyi bir çözünürlüklü kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanın. Bir ekstremiteden başlayarak slaytları analiz edin. Her mikroskobik alanı yakalayın.
Kalın kökler için 10 veya 40x büyütme ve ince kökler için 40x büyütme kullanın. Yakaladıktan sonra, her görüntüyü kök parçaların gerçek montajına izin verecek bir kodla yeniden adlandırın. Görüntü montajı için bir çizim tahtası tasarlamak üzere sunum yazılımını kullanın, genişliği görüntü genişliğinden iki ila üç santimetre daha geniş ayarlayın.
15 fotoğraf çektikten sonra, bir segmentten yakalanan tüm görüntüleri, bir ila 15 ile başlayarak yakalama sırasına göre ekleyin ve kök segmentin tüm uzunluğunu yeniden oluşturun. Ardından, merkezdeki görüntüleri hizalamak için dikey hizalamayı kullanın ve her görüntünün bir öncekini takip ettiğinden emin olun. Tüm kök segmenti kapsayacak şekilde tüm resimlere 10 x 150 hücreden oluşan bir ızgara yerleştirin.
Ek olarak, her resme ve bu ızgaranın her hücresine 10 x 10 ızgara yerleştirin, arbusküler mikorizal veya yapısı görünüyorsa bir ila altı arasında bir sayı ekleyin veya yapısı yoksa boş bırakın. Genişliği 10 hücreden ve uzunluğu 150 hücreden oluşan bir kılavuz için tablo ekleyin. Boyutları olan tabloyu görüntülerin genişliğine değiştirin, ardından tablonun uzunluğunu tüm görüntüleri içerecek şekilde değiştirin.
Mikorizal kolonizasyonu puanlamak için, mikorizal desen yönteminde açıklandığı gibi her bir yapı tipini puanlamak için benzersiz sayıyı kullanın. Hifalar için bir, arbusküller için iki, veziküller için üç, sporlar için dört, yardımcı hücreler için beş ve giriş noktaları için altı kullanın. Daha önce uygulanan ızgaraların her hücresinden gözlemlenen her mikorizal yapıyı puanlayın.
Puanlamadan sonra, elde edilen tüm puanları MycoPatt elektronik tablosuna ekleyin. Sunumdaki tüm puanları Ham Veri adlı ilk sayfaya aktarmak için kopyala yapıştır işlevini kullanın. Birincil analiz için, sonuçları üç biçimde ayrı ayrı yüzdeler olarak görselleştirmek için Parametreler adlı üçüncü sayfayı kullanın.
Kolonizasyonun yatay görüntüsünü analiz etmek için A'dan K'ya sütunları, kolonizasyonun dikey görüntüsü için M'den W'ye sütunları ve 15 10 x 10 karenin her biri için enine kolonizasyonu ve son ortalama kolonizasyonu analiz etmek için Y'den AI'ya sütunları kullanın. Ardından, her parametreye özgü tanımları ve formülleri uygulayın. Mikorizal haritaların üretimi ve çıkarılması için, mikorizal yapı kodunun renklere dönüştürülmesinden elde edilen görüntüyü Grafikler adlı ikinci sayfada görselleştirin.
Ardından, elde edilen görüntüyü grafik sayfasında görüntü olarak dışa aktarın ve mikorizal desenleri analiz etmek için göstergedeki renk kodunu kullanın. Mikorizal harita analizi için, en önemli yapıları ve bunların montajını tanımlayın. Daha sonra analiz edilen köklerde gözlenen mikorizal kolonizasyon paternini tanımlayın, ardından kökte gözlenen yapısal gelişime, dallanma paternine ve arbusküler vezikül gelişimine dayanan bir kolonizasyon stratejisi izleyin.
Bu protokol, Zea mays ve Festal rubra için mikorizal yapılar ve kök hücreler arasında iyi kontrast ile mikorizal yapıların ayrıntılarını sağlar. Başarısız temizleme ve boyama prosedürleri, Festal rubra ve Zea mays'taki mikorizal yapıların belirsiz mikroskobik görüntülerine neden oldu. Mikorizal kolonizasyon paternleri, kolonizasyon mekanizmasının tam bir şekilde araştırılmasına izin verdi, bu yöntem, kolonizasyon parametrelerinin ek bir görsel ifadesi ile Zea mays ve Festuca rubra için kolonizasyon modellerinin ve stratejilerinin derin, küçük ölçekli bir araştırmasını sağlar.
Zea Mays'te bitkinin gelişim aşamasına bağlı olarak oldukça dalgalanan kolonizasyon potansiyeli gözlenmiştir, ancak Festuca rubra'da kolonizasyon süreçleri köklerin içinde meydana gelir ve hifal ağlarının gelişimi köklerin düşük gelişim hızı ile ilişkilendirilmiştir. MycoPatt, herhangi bir bitkideki arbusküler mikorizal kolonizasyonun haritalandırılması için uygundur. Kolonizasyon mekanizmasını tam olarak araştırmak ve kökler boyunca mantar stratejisini değerlendirmek de yararlıdır.
