Protokolümüz, beyin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için gerekli olan devreden bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların araştırılmasını kolaylaştıracaktır. Temizleme tekniğimiz ScaleSF, hem büyük hem de küçük ölçekli yapıların eşzamanlı olarak görselleştirilmesi için gerekli olan yüksek düzeyde doku korumasının yanı sıra güçlü temizleme kabiliyeti de sunar. Protokolümüz özellikle nöronal hücrelerin ayrıntılı süreçler, muazzam bağlantılar sergilediği ve özel ince hücre altı yapıları düzenlediği beyinde etkilidir.
Deneye başlamadan önce, bu tabloda gösterildiği gibi Sca / eS çözeltileri hazırlayın ve numuneleri folyo ile örtün. Altı kuyucuklu hücre kültürü plakasının iki ayrı kuyucuğuna ScaleS0 ve ScaleS4 çözeltilerinin her birine sekiz mililitre ekleyerek prosedürü başlatın ve plakayı bir inkübatörde 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Beyin dilimlerini bir spatula ile önceden ısıtılmış ScaleS0 çözeltisine aktarın ve dilimleri 90 RPM'de titreyen bir inkübatörde 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra, geçirgenleştirilmiş beyin dilimlerini sekiz mililitre PBS eksi altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakasına aktarın ve 40 ila 60 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcıda tutarak 15 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Daha sonra, beyin dilimlerini sekiz mililitre önceden ısıtılmış ScaleS4 çözeltisine aktarın ve 37 santigrat derecede 90 RPM'de sekiz ila 12 saat boyunca inkübe edin.
Oda hazırlığı için, oda çerçevesini ve mikroskop sahne adaptörlerini 3D yazdırın. Oda çerçevesini basınca duyarlı bir yapıştırıcı kullanarak bir kapak kapağına takın. ScaleS4D25(0)çözeltisinde %1,5 agaroz hazırlayın.
Çözeltiyi karıştırın ve agaroz tamamen çözünene kadar mikrodalgada pişirin. Ardından çözeltinin 37 santigrat dereceye kadar soğumasına izin verin. Temizlenmiş beyin dilimini bir spatula ile görüntüleme odasının alt kapağına monte edin.
Fazla çözeltiyi temizlenmiş dilimden temiz bir doku kullanarak çıkarın. Görüntüleme odasını doldurmak için bir mikropipet kullanarak ScaleS4 jelini beyin dilimine ekleyin. Forseps ile üstüne başka bir kapak kayması yerleştirin, ardından bir parça kağıt mendil ve bir cam slayt izleyin.
Görüntüleme odasını dört santigrat derecede bir buzdolabına aktarın. Metal ağırlıkları cam slayta yerleştirin ve 30 dakika bekletin. Kuluçkadan sonra, malzemeyi görüntüleme odasından çıkarın ve fazla jeli silin.
Görüntüleme odasını 60 milimetrelik cam Petri kabına yerleştirin ve görüntüleme odasının kenarını basınca duyarlı bir yapıştırıcı ile tabağa birden fazla noktadan takın. ScaleS4 çözeltisini kabın içine dökün ve 20 ila 25 santigrat derecede 40 ila 60 RPM'de bir saat boyunca hafifçe çalkalayın. Taze çözelti ile değiştirin ve bir pipet ucu kullanarak yüzeyi nazikçe kazıyarak jel yüzeyindeki hava kabarcıklarını çıkarın.
Görüntüleme odasını mikroskop aşamasına monte edin. 2,5 milimetre çalışma mesafesi, 16x büyütme ve 0,60 sayısal diyafram açıklığına sahip çok daldırmalı objektif lens ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu hazırlayın. İş istasyonu, mikroskop, tarayıcı, lazerler, cıva lambası gibi ilgili tüm görüntüleme ekipmanlarını açın ve bir görüntüleme yazılımı başlatın.
Çok daldırmalı objektif lensin düzeltme yakasını 1,47'ye ayarlayın. Objektif lensi çözeltiye daldırın ve dilime yavaşça yaklaşmasına izin verin. Objektif lensin ucunda sıkışmış tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
Epifloresan kullanarak temizlenmiş dokularla ilgili ilgi alanlarını bulun. Görüntü alma parametrelerini ayarlamak için, önce görüntünün boyutu bitle birlikte arttıkça görüntü alma için bit derinliğini belirleyin. Ardından algılama dalga boyunu emisyon spektrumuna göre ayarlayın.
XY çözünürlüğünü, tarama hızını ve iğne deliği boyutunu ayarlayın. Ayrıca lazer gücünü, dedektör amplifikatör kazancını ayarlayın ve uygun bir görüntü elde edilene kadar ofsetleyin. YG'nin boyutuna göre döşeme boyutunu belirleyin ve YG'nin tüm uzunluğunun ve genişliğinin yakalanmasını sağlayın.
Tüm düzlemlerde doku arasında gezinin ve yığının başlangıcını ve bitiş noktalarını ayarlayın. İstenilen Z çözünürlüğüne göre Z adım boyutunu ayarlayın. Görüntüleri toplayın ve görüntü analiz yazılımını kullanarak işleyin.
Bu protokol kullanılarak, bir milimetre kalınlığında bir fare beyin diliminin optik olarak temizlenmesi sağlandı. PV-FGL farelerin serebral korteksindeki EGFP ekspresyonu, dokuların floresansının ve yapısal bütünlüğünün korunduğunu göstermiştir. Kırılma indisi uyumsuzluğuna bağlı anormallikler, EGFP pozitif nöronların görüntü parlaklığında ve çözünürlüğünde gözle görülür bir kayba neden oldu.
Bu nöronlar, düzeltme tasması bu ScaleS4 çözümüne uyacak şekilde ayarlandığında konfokal lazer tarama mikroskobu ile açıkça görselleştirildi. Fare primer somatosensoriyel korteksindeki EGFP etiketli nöronların 3D rekonstrüksiyonu bir milimetre kalınlığında bir beyin diliminde yapıldı. Dendritik dikenlerle süslenmiş bireysel dendritik arbors daha yüksek büyütmede görülmüştür.
Dilimlerde akson terminal arborizasyonu ve aksonal butonlar da gözlendi. Görüntüleme sıvısı ve nesne lensi arasındaki yansıtıcı indeks eşleşmesi, temizlenmiş dokularda 3D görüntüleme için kritik öneme sahiptir. Tekniğimiz, nöron yapısını devreden bileşen ölçeklerine entegre etmeyi kolaylaştıracak, nöron mekanizmalarına, beyindeki işleme bilgisine dair bilgiler sağlayacaktır.
