Bu protokol, araştırmacının ilgilendiği arteri disseke etmesine ve çok çeşitli fonksiyonel testler yapmak için vasküler hücreleri izole etmesine izin verecektir. Araştırmacı, vasküler hücre biyolojisi ve vasküler disfonksiyon mekanizması hakkındaki bilgileri genişletmek için farklı vasküler yatakları ve hücre tiplerini araştırabilir. Bu yöntem en çok temel vasküler hücre biyolojisini araştıran araştırmacılar ve ayrıca hayvan hastalık modellerinde vasküler hücre disfonksiyonunu araştıran araştırmacılar için geçerlidir.
Sindirim protokolünü optimize etmek için, özellikle ilgilenilen vasküler yatakların burada sunulanlardan farklı olduğu durumlarda özel dikkat gösterilmelidir. Başlamak için, diseksiyon pimlerini kullanarak fareyi sabitleyin ve ventral yüzeye% 70 etanol püskürtün. Cildi cinsel organların hemen üstüne kaldırmak için forseps kullanın ve ciltte yaklaşık iki milimetrelik küçük bir kesi yapın.
Makasın ucunu kesi bölgesine yerleştirin ve ilk kesiden başlayarak sternumun tabanına kraniyal olarak diseksiyon yapan dört ila beş santimetre uzunluğunda bir orta hat kesisi yapın. Ön ekstremitenin hemen altındaki orta hattan lateral olarak uzanan bir santimetrelik bir kesi yapın. Arka bacak ve cinsel organlar arasında çapraz bir santimetre kesi yapın.
İlişkili bağ dokusunu soymak için orta hat cilt kesileri boyunca küçük kesikler yapın ve deri altı yağ deposunu açığa çıkarın. C şeklindeki deri altı yağ dokusunu ve karın boşluğuna dik olarak çalışan arteri veya damarı tanımlayın. Cinsel organların yakınındaki C şeklinin altından başlayın ve bağ dokularını açığa çıkarmak için yağ dokusunu yavaşça kavrayın.
Yağı deriden ayırmak için bağ dokusunda küçük kesikler yapın ve maruz kalan vaskülatürü rahatsız etmekten kaçının. Subkutan yağ dokusu sağlam bir şekilde çıkarılana kadar bağ dokusunu diseksiyona devam edin. Maruz kalan arteri çevreleyen bağ dokusundan dikkatlice ayırın.
İzole edilmiş deri altı yağını buz üzerindeki HEPES tamponunda saklayın. Kalan posterior subkutan yağ deposu için diseksiyonu tekrarlayın. Mezenterik yağ deposunu izole etmek için, idrar kesesinin üzerindeki ince periton boşluğu duvarını kaldırmak için Graefe Forseps kullanın ve düz makas kullanarak küçük bir kesi yapın.
Peritoneal boşluk duvarını yavaşça kaldırın ve düz iris makasını insizyon bölgesine yerleştirin. İdrar kesesinden sternuma dört ila beş santimetrelik bir kesi yapın. Ardından, orta çizgiden arka bacağın hemen üstüne ve ön bacağın altına yanal olarak uzanan düz iris makası ile bir santimetrelik iki yatay kesi yapın.
Karın kas sistemini soymak ve periton visserasını açığa çıkarmak için Graefe forsepslerini kullanın. Mezenterik adipozu ortaya çıkarmak için bağırsakları viseral boşluktan çıkarmak için bir çift beş numaralı forseps kullanın. Kavisli makası ve beş numaralı forsepsleri kullanarak yağ yağını kolon boyunca ayırın, çekumdan başlayarak kolonun görüşten indiği yere kadar.
Ardından, ince bağırsak boyunca yağları pankreasa ayırın. Mezenterik adipozu tamamen izole etmek için pankreasın küçük bir kısmını çıkarın. İzole mezenterik yağın buz üzerindeki HEPES tamponunda saklanması.
Arterleri izole etmek için, önce yağ dokusunu 10 mililitre soğuk HEPES tamponu içeren diseksiyon kabına aktarın. Bir stereo mikroskop altında, arter ven çiftini açığa çıkarmak için deri altı yağ dokusunu konumlandırın. Karnabahar şeklini ve ilgili arter ven çiftini ortaya çıkarmak için viseral yağ dokusunu konumlandırın.
Parankimal yağın arterden dikkatlice çıkarılması için 55 numaralı forseps kullanın. İlgilenilen damarlara zarar vermeden bir seferde küçük yağ parçalarını çıkarın. Arterler parankimal yağ dokusundan tamamen boşalana kadar devam edin.
Temizlenmiş arterleri taze HEPES tamponlu yeni bir tüpe aktarmak için beş numaralı forseps kullanın ve sindirime hazır olana kadar buz üzerinde tutun. İlk olarak, iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne her biri bir miligram dispaz ve elastaz ekleyin. İki mililitre ayrışma çözeltisi, vorteks ekleyin ve tamamen çözünene kadar 37 santigrat derecede inkübe edin.
Temizlenen arterleri ilgili numune tüplerine aktarmak için beş numaralı forseps kullanın. Tüpleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 10 ila 15 dakikada bir ters çevirerek nazik ajitasyonla inkübe edin. Bu arada, yeni tüplere numune başına bir miligram kollajenaz tipi ekleyin.
Kuluçkadan sonra, arterlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve tamponun 500 mikrolitresini üstten kollajenaz içeren tüplere aktarın. Vorteks yapın ve bu çözeltiyi ilgili numune tüplerine geri gönderin. Numuneleri 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Numune tüpünü salladıktan sonra arterlerin parçalara ayrıldığından emin olun. Bir cam pipet kullanarak, hücreleri mekanik olarak ayırmak için sindirilmiş dokuyu 10 ila 15 kez kuvvetlice tritüre edin. Tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için sindirilmiş numuneleri 70 mikronluk bir hücre süzgecinden veya bir akış sitometri tüp süzgecinden geçirin.
Tek hücreli süspansiyonu santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücre peletini bir mililitre PBS içinde% 5 BSA ile 30 dakika boyunca tekrar askıya alın. Bir mikrolitre hücre canlılığı lekesi ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
Hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre peletini %1 BSA ile 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. CD31 ve CD45'e konjuge edilmiş birincil antikorları ekleyin ve buzdolabında 15 dakika boyunca bir rocker üzerinde inkübe edin. Doğrudan hücre süspansiyonuna% 1 BSA ile bir mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın.
Hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve% 0.1 BSA ile 200 mikrolitre% 1 formaldehit içinde peleti tekrar askıya alın. Tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve akış sitometrisine hazır olana kadar buzdolabında saklayın. Sindirilmiş subkutan yağ arterlerinden elde edilen hücre preparatları, akım sitometrisi kullanılarak endotel hücre popülasyonlarını tanımlamak için kullanıldı.
CD31 pozitif CD45 negatif hücreler endotel hücreleri olarak tanımlandı. Hücre canlılığı boyası, sadece fiksasyondan önce izolasyon ve sindirim protokolünden kurtulan canlı hücrelerin tanımlanmasına izin verdi. Farklı yağ deposu vaskülatüründen membran protein ekspresyonu ve endotel hücrelerindeki farklılıkları tanımlamak için, izole hücreler yağ asidi translokaz CD36 için incelendi.
CD36 pozitif endotel hücreleri subkutan ve mezenterik adipozda tanımlandı. CD36 ekspresyonu ile subkutan ve mezenterik endotel hücrelerinin nicelleştirilmesi, subkutan endotel hücrelerinde hem CD36 ekspresyonunu eksprese eden endotel hücrelerinin yüzdesinin hem de CD36 ekspresyonunun yoğunluğunun daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Arterleri dikkatlice parçalara ayırmak, tanımlamak ve temizlemek çok önemlidir.
En önemlisi, sindirim protokolü, aşağı akış uygulamaları için yeterli miktarda canlı hücre üretmelidir. Bu prosedürü takiben, izole hücre popülasyonu, in vitro ilaç taraması için elektrofizyoloji, moleküler profilleme ve birincil hücre hattının oluşturulması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere uygulamalar için kullanılabilir.
