Les astrocytes sont une population autogène intéressante à cibler pour la programmation neuronale directe. Ce protocole fournit une technique fiable pour isoler les astrocytes de culture de haute pureté de différentes régions ou du système nerveux central. Ce protocole est conçu et optimisé pour étudier la capacité des astrocytes à être reprogrammés en neurones fonctionnels sans facteurs de confusion tels que les différences de pureté des astrocytes de différentes populations de démarrage.
La démonstration de la procédure sera effectuée par Bob Hersbach, postdoc au laboratoire, et Tatiana Simon, une assistance technique dans notre laboratoire. Pour commencer, placez le torse d’une souris euthanasiée dans une boîte de Petri de 35 millimètres et gardez-la sur de la glace. Ouvrez la peau avec des ciseaux et retirez la vertèbre avec de petits ciseaux.
Ensuite, extrayez la moelle épinière et placez-la dans un tampon de dissection sur de la glace. Sous un microscope à dissection stéréotaxique avec un grossissement de deux fois, retirer les méninges de la moelle épinière isolée à l’aide d’une pince et transférer le tissu de la moelle épinière disséqué et nettoyé dans un tube C. Ajouter 50 microlitres d’enzyme P du kit de dissociation du tissu neural et 30 microlitres de mélange d’enzymes préalablement préparé à chaque tube C.
Retourner les tubes C et les placer sur un tube dissocié chauffé en veillant à ce que tous les tissus soient recueillis dans le couvercle du tube. Éluder les cellules en retirant la colonne du séparateur en ajoutant 800 microlitres de milieu de culture astrocytaire et en poussant les cellules hors de la colonne avec le piston inclus. Les cellules en plaques dans les flacons de culture précédemment préparés en ajoutant 4,2 millilitres de milieu de culture astrocytaire complété par 10 nanogrammes par millilitre d’EGF et de bFGF.
Il n’est pas nécessaire d’enduire les flacons de culture pour les astrocytes isolés d’autres régions du cerveau, mais cela fournit un meilleur substrat pour les astrocytes isolés de la moelle épinière. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Effectuer des sièges d’astrocytes sous une armoire de sécurité biologique avec un niveau de sécurité un et préparer 24 plaques de puits avec des couvercles en verre revêtu de poly-D-Lysine comme décrit dans le manuscrit du texte.
Pour le placage, isoler six moelles épinières de souris P2 donne environ 1 million de cellules. Aspirer les milieux des flacons de culture T-12.5 contenant les astrocytes cultivés et laver une fois avec 1x PBS. Détacher les astrocytes du flacon de culture en ajoutant 0,5 millilitre d’EDTA à 0,05% de trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Tapoter doucement le côté de la fiole pour libérer les cellules de la surface du flacon de culture et vérifier le détachement au microscope à fond clair à l’aide d’un grossissement de 10 fois. Arrêtez la trypsinazation avec 2,5 millilitres de milieu de culture astrocytaire et recueillez la suspension cellulaire dans des tubes de 15 millilitres. Centrifuger à 300 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirer le surnageant et renvoyer les cellules dans un millilitre de milieu de culture astrocytaire. Calculez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un système automatisé de comptage cellulaire. En fonction du nombre de cellules, diluer la suspension cellulaire avec un milieu astrocytaire frais complété par EGF et bFGF à 10 nanogrammes par millilitre et par facteur.
Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits des 24 plaques de puits et des cellules de culture préparées précédemment à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Préparer le milieu de différenciation neuronale en ajoutant un supplément de B27 millilitre à 49 millilitres de milieu de culture de base. Après 24 à 48 heures, selon que les cellules ont été transduites ou transfectées, remplacer le milieu astrocytaire par un milieu de différenciation neuronale d’un millilitre par puits.
Culture des cellules à 37 degrés Celsius avec 9% de dioxyde de carbone. Pour augmenter l’efficacité de la reprogrammation, compléter le milieu de différenciation neuronale avec de la forskoline et de la dorsomorphine jusqu’à une concentration finale de 30 micromolaires et une micromolaire respectivement en remplaçant le milieu astrocytaire par le milieu de différenciation. Lorsque vous choisissez de traiter les cellules avec de la forskoline et de la dorsomorphine, fournissez une deuxième dose de dorsomorphine deux jours après le traitement initial.
Ajouter ce deuxième traitement directement sur le milieu de culture. Les cultures primaires d’astrocytes ont atteint 80 à 90% de confluence entre sept et 10 jours après le tri et le placage cellulaire assisté par magnétose. Le lendemain du placage, les cellules couvraient généralement 50 à 60 % de la surface du couvercle.
Les cultures étaient principalement constituées d’astrocytes à ce stade, tandis que d’autres types de cellules telles que les explosions neurologiques étaient pratiquement absents. Sept jours après la transduction ou la transfection, les cellules neuronales induites se distinguaient clairement des astrocytes. Le soma cellulaire neuronal était plus petit que les astrocytes non reprogrammés avaient des processus longs et étaient positifs pour le marqueur neuronal, la tubuline bêta-trois et négatif pour le marqueur astrocytaire GFAP.
21 jours après la transduction ou la transfection, de nombreux neurones induits étaient capables de déclencher des potentiels d’action et étaient positifs pour le marqueur neuronal mature NeuN et la protéine pan synaptique Synaptophysine. Il est essentiel de bien disséquer la région d’intérêt. Éviter la contamination par les tissus environnants.
Il faut prendre soin d’enlever les méninges et les ganglions de la racine dorsose de la moelle épinière isolée. Cette méthode peut être utilisée pour isoler les astrocytes de diverses régions du système nerveux central, y compris le cortex cérébral, le mésencéphale dorsal et le cervelet. À l’avenir, cette technique nous permettra d’élargir nos connaissances sur les astrocytes régionaux et leur potentiel à être reprogrammés en neurones fonctionnels.
