Gli astrociti sono un'interessante popolazione autogena da indirizzare per la programmazione neuronale diretta. Questo protocollo fornisce una tecnica affidabile per isolare astrociti di coltura con elevata purezza da diverse regioni o dal sistema nervoso centrale. Questo protocollo è progettato e ottimizzato per studiare la capacità degli astrociti di essere riprogrammati in neuroni funzionali senza fattori confondenti come le differenze nella purezza degli astrociti di diverse popolazioni di avvio.
La dimostrazione della procedura sarà eseguita da Bob Hersbach, Postdoc in laboratorio, e Tatiana Simon un'assistenza tecnica nel nostro laboratorio. Per iniziare, posiziona il torso di un topo eutanasia in una capsula di Petri da 35 millimetri e tienilo sul ghiaccio. Apri la pelle con le forbici e rimuovi la vertebra con piccole forbici.
Quindi estrarre il midollo spinale e metterlo in un tampone di dissezione sul ghiaccio. Sotto un microscopio a dissezione stereotassica con ingrandimento due volte, rimuovere le meningi dal midollo spinale isolato usando una pinza e trasferire il tessuto del midollo spinale sezionato e pulito in un tubo C. Aggiungere 50 microlitri di enzima P dal kit di dissociazione del tessuto neurale e 30 microlitri di miscela enzimatica precedentemente preparata a ciascun tubo C.
Capovolgere i tubi C e posizionarli su un riscaldato dissociato assicurandosi che tutto il tessuto sia raccolto nel coperchio del tubo. Eludere le cellule rimuovendo la colonna dal separatore aggiungendo 800 microlitri di terreno di coltura di astrociti e spingendo le cellule fuori dalla colonna con lo stantuffo incluso. Cellule a piastre nei palloni di coltura precedentemente preparati aggiungendo 4,2 millilitri di terreno di coltura di astrociti integrati con 10 nanogrammi per millilitri di EGF e bFGF.
Non è necessario rivestire i palloni di coltura per astrociti isolati da altre regioni del cervello, ma fornisce un substrato migliore per gli astrociti isolati dal midollo spinale. Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Eseguire posti a sedere astrocitari sotto un armadio di sicurezza biologica con un livello di sicurezza uno e preparare 24 piastre di pozzetto con vetrini di copertura rivestiti di poli-D-lisina come descritto nel manoscritto di testo.
Per la placcatura, isolare sei midollo spinale da topi P2 produce circa 1 milione di cellule. Aspirare i mezzi dai palloni di coltura T-12.5 contenenti gli astrociti coltivati e lavare una volta con 1x PBS. Staccare gli astrociti dal pallone di coltura aggiungendo 0,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05% e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Picchiettare delicatamente il lato del pallone per liberare le cellule dalla superficie del pallone di coltura e controllare il distacco al microscopio a campo chiaro utilizzando un ingrandimento di 10 volte. Interrompere la tripsinazione con 2,5 millilitri di terreno di coltura di astrociti e raccogliere la sospensione cellulare in tubi da 15 millilitri. Centrifugare a 300 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e inviare nuovamente le cellule in un millilitro di terreno di coltura di astrociti. Calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un sistema automatizzato di conteggio delle cellule. In base al numero di cellule, diluire la sospensione cellulare con terreno di astrociti fresco integrato con EGF e bFGF a 10 nanogrammi per millilitro per fattore.
Aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto delle 24 piastre e celle di coltura precedentemente preparate a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Preparare il mezzo di differenziazione neuronale aggiungendo un millilitro di B27 supplemento a 49 millilitri di terreno di coltura di base. Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate, sostituire il mezzo astrocitario con un mezzo di differenziazione neuronale millilitro per pozzetto.
Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius con il 9% di anidride carbonica. Per aumentare l'efficienza di riprogrammazione, integrare il mezzo di differenziazione neuronale con forskolina e dorsomorfina ad una concentrazione finale di 30 micromolari e un micromolare rispettivamente quando si sostituisce il mezzo astrocitario con il mezzo di differenziazione. Quando si sceglie di trattare le cellule con forskolina e dorsomorfina fornire una seconda dose di dorsomorfina due giorni dopo il trattamento iniziale.
Aggiungere questo secondo trattamento direttamente al terreno di coltura. Le colture primarie di astrociti hanno raggiunto l'80-90% di confluenza tra sette e 10 giorni dopo la selezione e la placcatura cellulare assistita da magnetico. Il giorno dopo la placcatura, le celle coprivano in genere dal 50 al 60% della superficie di scorrimento del coperchio.
Le colture consistevano principalmente di astrociti in questa fase, mentre altri tipi di cellule come i neuroblasti erano praticamente assenti. A sette giorni dalla trasduzione o dalla trasfezione, le cellule neuronali indotte erano chiaramente distinguibili dagli astrociti. Il soma delle cellule neuronali era più piccolo di quello non riprogrammato Gli astrociti avevano processi lunghi ed erano positivi per il marcatore neuronale, la tubulina beta tre e negativo per il marcatore astrocitario GFAP.
A 21 giorni dalla trasduzione o trasfezione, molti neuroni indotti erano in grado di attivare potenziali d'azione ed erano positivi per il marcatore neuronale maturo NeuN e la proteina sinaptica pan sinaptofisina. È essenziale sezionare correttamente la regione di interesse. Evitare la contaminazione dal tessuto circostante.
Bisogna fare attenzione a rimuovere le meningi e i gangli della radice dorsale dal midollo spinale isolato. Questo metodo può essere utilizzato per isolare gli astrociti da varie regioni del sistema nervoso centrale, tra cui la corteccia cerebrale, il mesencefalo dorsale e il cervelletto. In futuro, questa tecnica ci permetterà di espandere le nostre conoscenze sugli astrociti regionali e sul loro potenziale per essere riprogrammati in neuroni funzionali.
