Kodlamayan RNA'larda genellikle birden çok isoform olur. In vitro aşırı ekspresyon çalışmalarında, tüm bu ifade edilmiş isoformları incelemek genellikle zordur. Bu teknik, kullanıcıların doğrudan genomdan ifade elde etmelerini ve hücrelerin kodlamayan belirli bir RNA için endojen İzoformları ifade etmelerini sağlar.

Bu güçlü teknik, kullanıcının genomdaki herhangi bir genin ifadesini doğruluk ve doğrulukla özellikle yönlendirmesini sağlar. Belirli genlere kılavuz RNA'lar tasarlayarak, belirli bir hücredeki doğal isoformları ifade etmek için endojen gen birleştirme makinelerini kullanabilmek mümkündür. Prosedürü gösteren Robert Rankin, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır.

Transkripsiyonel başlangıç sitesinin 100 baz çifti içinde yer alan kılavuz RNA dizisini tasarlamak için, kılavuz RNA'nın ilgi genine özgü olduğundan emin olmak için BLAT gibi genetik veritabanlarını kullanın. Kılavuz RNA'yı ve devre dışı bırakılmış Cas9 plazmidlerini dört santigrat derecede saklayın. Ampicillin ile luria suyu agar plaka üzerinde E.coli dışarı Çizgi ve 37 santigrat derece bir gecede bakteri büyümek.

Ertesi gün, bir koloni seçin ve bir gecede ampisilin ile LB beş mililitre bakteri büyümek, şiddetle 37 derecelik santigrat kuvöz tüp sallayarak. Ertesi gün, iki litrelik bir şişe de ampisilin ile LB 200 mililitre bakteri iki mililitre ekleyin, şiddetle 37 derecelik santigrat kuvöz de bir gecede şişe sallayarak. Bakterileri 3, 724 kez 20 dakika boyunca aşağı doğru çevirin ve DNA arınmaya devam edin.

dCas9 içeren lentivirüs oluşturmak için, ilk kat 100 mililitre doku kültürü yemekleri ile beş mililitre ile 0.01% Poli-L-L-Lizin ve plaka beş milyon HEK293T hücreleri çanak başına tam Dulbecco's Modifiye Eagles Orta 10 mililitre, sonra bir LTR içeren kılavuz RNA vektör veya bir LTR içeren Cas9 içeren vektör plasmids bileşenleri içeren bileşenleri içeren 10 mikrogram karıştırarak DNA transfeksiyon örnekleri hazırlamak. Toplam hacmi 450 mikrolitre ye su ekleyin ve karışımı şırıngaya bağlı 0,2 mikronluk bir filtre ucuyla filtreleyin. Daha sonra, DNA'nın her transfeksiyon örneğine 50 mikrolitre 2,5 molar kalsiyum diklorür ekleyin ve hafifçe karıştırın.

Kalsiyum-DNA karışımını şırıngaya bağlı 0,2 mikronluk bir filtre ucuyla filtreleyin. Pipet 500 mikrolitre 2X HBS beş mililitre polistiren tüp içine. Kalsiyum-DNA karışımı damla ve yavaşça girdap 500 mikrolitre ekleyin.

Üç dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Her HEK293T içeren doku kültürü çanak dna-kalsiyum HBS süspansiyon bir mililitre ekleyin ve bir gecede 37 derece santigrat derecede% 5 karbondioksit kuluçka onları kuluçka. Üçüncü gün, yavaşça kaldırın ve bulaşıklardan medya atın.

Hücreleri pbs ile dikkatlice yıkayın. 20 milimolar HEPES ve 10 milimolar sodyum bütirat ile takviye tam DMEM altı mililitre ekleyin. Sonra hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 5-6 saat kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve HEK293T hücrelerine 20 milimolar HEPES ile beş mililitre tam DMEM ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 12 saat kuluçkaya yatırın. Dördüncü gün, HEK293T hücre supernatants toplamak ve virüs içeren supernatant filtre.

Viral partikül sayılarına başlamak için, önce p24 ELISA kitinden yıkama konsantresini 19 parça distile, deiyonize su ekleyerek seyreltin. Daha sonra, seyreltici olarak RPMI 1640 kullanarak mililitre başına 200 nanogram bu kiti pozitif kontrol seyreltmek ve P24 ELISA seyreltme tablosuna göre 1.5 mililitrelik tüpler standart bir eğri için seyreltme yapmak. Numuneler içindeki virüsün konsantrasyonunun ölçülmesi için numune seyreltmelerini 1:1000'den başlayan 96 kuyuluk bir plakanın belirlenmiş kuyularına ekleyin ve standart eğrinin menzilinde olmak için hacmi gerektiği gibi değiştirin.

Daha sonra triton X-100 ile numuneleri %0,5'lik son konsantrasyona seyreltin ve belirlenen kuyulara her numunenin 200 mikrolitresini ve RPMI 1640'ı ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. 1X yıkama tamponunun kuyubaşına 300 mikrolitre ile plakayı yıkayın.

Plaka ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerine dokunarak herhangi bir fazla sıvı çıkarın. Daha sonra 100 mikrolitre dedektör antikor ekleyin kiti boş substrat hariç tüm kuyulara. Plakayı kapatın ve 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.

Plakayı yıkayın ve sonra plaka ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerine dokunarak herhangi bir fazla sıvı çıkarın. Dedektör antikor ölçmek için, SA-HRP seyreltici ile 1:100 seyreltme streptavidin horseradish peroksidaz seyreltmek. Seyreltilmiş SA-HRP iyice karıştırın ve boş hariç tüm kuyulara 100 mikrolitre ekleyin.

30 dakika oda sıcaklığında plaka mühür ve kuluçka. Daha sonra, 1X yıkama tampon ile plaka yıkayın ve herhangi bir fazla sıvı uzak dokunun. Bir tabak için yeterli substrat çözeltisi yapmak için substrat diluent 11 mililitre bir orto-fenilenediamin tablet bırakın.

Vortex OPD çözeltisi şiddetle tamamen eritmek ve ışıktan korumak için. Boş dahil olmak üzere tüm kuyulara 100 mikrolitre OPD substrat çözeltisi ekleyin. Spektrofotometre kullanarak, emmeyi hemen 450 nanometrede okuyun.

Bir saniyelik aralıklarla 10 kez tekrarlayın ve ortalama ölçümü alın. Resuspend ve kültür Jurkat T-hücreleri polibren ile azaltılmış serum media beş mililitre bir milyon hücre yoğunluğu ile bir T75 şişesinde. Ardından, bir milyon dCas9 içeren viral partikül içeren HEK293T klimalı ortam ekleyin.

Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra enfeksiyon, beş dakika için 233 zaman g hücreleri aşağı spin ve tam DMEM 10 mililitre püromisin ile takviye onları yeniden askıya. Kültür T75 şişeleri hücreleri ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece onları kuluçka.

Dokuz günlük bir süre için her üç günde bir, hücreleri 233 kez g beş dakika boyunca aşağı spin ve puromisin ile takviye tam DMEM ile medya değiştirin. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, doku kültürü tedavi doku ile 96-iyi plaka üzerinde, ilk kuyuda püromisin ile desteklenen tam DMEM 100 mikrolitre 10.000 hücreleri ekleyin.

Puromisin ile desteklenen tam DMEM ile aşağıdaki kuyuların içeriğinin 1:1 seri seyreltme olun. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Klonal hücreleri iki 24 kuyuplakaya genişletin, sonra klonların üçü için altı kuyulu bir plakanın kuyusu başına iki milyon hücreyi kapatın.

Kontrol olarak transeme olmayan Jurkat hücreleri ile diğer üç kuyu plaka. Son olarak, hücreleri bir T75 şişesine koyun ve hücreleri bir gece boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine koyun. Gen ekspresyonunu ölçmek için kantitatif PCR'ye başlamak için, ilk olarak bir mikrogram RNA, dört mikrolitre cDNA sentez tamponu ve bir mikrolitre ters transkriptaz ile 250 mikrolitrelik son hacmine su ekleyerek tamamlayıcı DNA sentezleyin.

Daha sonra, 42 santigrat derecede 30 dakika ve 95 santigrat derecede bir termal döngücünü kullanarak ters transkriptazı inaktive edin. Sentezden sonra 60 mikrolitre su ile cDNA seyreltin. 10 mikromolar, beş mikrolitre SYBR yeşili ve dört mikrolitre cDNA konsantrasyonunda her bir ileri ve ters astarın 0,5 mikrolitresini içeren tüpler için polimeraz zincir reaksiyonları çalıştırın.

Son olarak 10 gün boyunca Hygromisin B ile desteklenen DMEM'deki Jurkat-dCas9 hücrelerini seçin. Hücreleri aşağı çevirin ve her üç günde bir ortamı değiştirin. RNAse'yi arındırın ve RT-qPCR'ye ilerleyin.

Bu çalışmada, transkripsiyonel başlangıç sitesinden 10 ila 100 baz çifti uzaklıkta bulunan GRNA dizileri, cas9 aktive kompleksini inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkili uzun bir kodlamayan RNA olan IFNG-AS1'in transkripsiyonel lokusuna yönlendirmek için kullanılmıştır. Çift transeksif hücrelerin seçimini sağlamak için, iki plazmid sistemi hücrelere dCas9 veya gRNAAse arttırıcıları nakletmek için kullanılmıştır. Burada MS2 proteinleri IFNG-AS1 aşırı ekspresyonu artırmak.

Cas9 ifadesi her iki klon için de doğrulandı. HPRT1'e karşı astarlar, transeneden olmayan hücrelerde RNA varlığını doğrulamak için kullanıldı. mRNA ekspresyonu cDNA reaksiyonundan ters transkriptaz atlayarak doğrulandı.

IFNG-AS1'in üç splice varyantı, transkripte özgü astar kümeleri veya bilinen tüm IFNG-AS1 transkriptlerine karşı bir astar seti ile tespit edilebilir. Tüm floresan eğrileri, kontrol ve IFNG-AS1 gRNA ifade eden hücreler arasında yarım döngü içinde üstel faza ulaşan HPRT1 temizlik geni HPRT1 ile üstel olarak elde edildi. Bilinen tüm IFNG-AS1 transkriptlerine karşı astarlar deneyler arasında en çok saptanabilen ler olup, IFNG-AS1 ekspresyonunda 20 kat artış lar yapıldı.

Ancak IFNG-AS1'in üçüncü transkripti IFNG-AS1 düzeylerinde beş ila 10 kat anlamlı bir artış gösterdi. İstediğiniz geni aktif olarak aşırı eksprese etmek için, 2.1. Ayrıca, kaliteli viral parçacıkların üretimi protokol bileşenlerisağlam bir ifade sağlayacaktır.

İstenilen gen aşırı eksprese edildikten sonra gen mekanizmalarını araştırmak için fonksiyonel çalışmalar yapılabilir. Örneğimizde, ilgi genimizin aşırı ekspresyonu sonrasında sitokin üretimine bakmayı seçtik. Bu teknik ilk olarak 2013 yılında Griesbach Grubu tarafından geliştirilmiş ve diğer gruplar tarafından geniş ölçüde uygulanmış ve ayrıntılı olarak geliştirilmiştir.

Bu tekniği, belirli işlevlerini keşfetmek için uzun kodsuz RNA'lara uygulayacak ları için heyecanlıyorduk. Replikasyon kusurlu lentivirüsler viral çalışma için onaylanmış bir laboratuvarda ele alınmalıdır. Ayrıca, insan hücre hatları ve E.coli bakterileri biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir.

Son olarak, rekombinant DNA plazmidleri eğitimli personel tarafından ele alınmalıdır.