Bu protokol, hedeflenmemiş metabolomik analiz sırasında ksenobiyotiklerin yonca üzerindeki etkisinin nasıl değerlendirileceğini açıklamaktadır. Teknik operasyon için çok basit ve kullanışlıdır ve daha fazla kök eksüda türü tanımlanabilir. Bu, bitki kökü eksüdalarının metabolomik parmak izini oluşturmaya yardımcı olur.
Medicago sativa veya yonca tohumlarının sterilizasyonuna, tohumları% 0.1 sodyum hipoklorit ile 10 dakika boyunca durulayarak başlayın. Ardından 30 dakika boyunca% 75 etil alkol ile yıkayın. Daha sonra, sterilize edilmiş tohumları damıtılmış suyla birkaç kez durulayın.
Ve sonra onları steril bir petri kabına yerleştirilmiş nemli filtre kağıdı üzerinde çimlendirin. Karanlıkta 30 santigrat derecede. Çimlenmeden sonra, 20 adet düzgün çimlenmiş büyük dolgun tohumu, besin çözeltisi ile doldurulmuş bir kültür şişesinde bir aşılama sepetine aktarın.
Tüm kültür şişelerini kontrollü koşullara sahip bir büyüme odasına yerleştirin. İki hafta sonra, kültür deneyi için 15 üniform yonca fidanını kilogram başına bir miligram ve kilogram başına 10 miligram DEHP stresine maruz bırakmak için yeni bir cam şişeye aktarın. DEHP'nin fotolizini ve uçuculaşmasını önlemek için işlem ve kontrol cam şişelerini alüminyum folyo ve parafilm ile sarın.
Sıvı seviyesini korumak için besin çözeltisini günlük olarak takviye edin. Yonca fideleri için tutarlı büyüme koşulları sağlamak için şişeleri her iki günde bir rastgele yerleştirin ve döndürün. Yedi günlük ekimden sonra, yonca fidelerini şişelerden çıkarın.
Ve kök eksüdalarının toplanmasına hazırlamak için birkaç kez ultra saf suyla yıkayın. Kök eksüda toplama deneyine, 10 üniform yonca fidanını 50 mililitre sterilize deiyonize su ile doldurulmuş santrifüj tüplerine aktararak başlayın. Kök eksüdalarını toplamak için, tüpleri suya batırılmış köklerle altı saat boyunca dik tutun.
İşiniz bittiğinde, kökleri ışıktan korumak için santrifüj tüplerini alüminyum folyo ile sarın. Bitkileri çıkarın ve metabolit profillemesi için toplanan sıvıyı dondurarak kurutun. Dondurularak kurutulmuş numunelere 1,8 mililitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyerek ekstraksiyon deneyine devam edin.
30 saniye boyunca vortekste. Daha sonra, ultrason dalgalarını bir buzlu su banyosunda 10 dakika boyunca tüplere uygulayın. Numuneleri santrifüj etmeden önce.
200 mikrolitre süpernatantı 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Santrifüj tüpünden 45 mikrolitre süpernatant aspire edin ve 270 mikrolitrelik nihai bir hacimde kalite kontrol veya QC numunelerine karıştırın. Tamamlandığında, ekstraktları bir vakum konsantratöründe dondurarak kurutun.
Kurutma tamamlandıktan sonra, beş mikrolitre dahili standart ribonükleaz ekleyin ve kurumaya devam edin. Buharlaşmadan sonra, 30 mikrolitre metoksiaminasyon hidroklorür çözeltisi ekleyin ve tüpleri 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tüpleri türevlendirme için 1,5 saat boyunca 70 santigrat dereceye yerleştirmeden önce numunelere 40 mikrolitre BSTFA reaktifi ekleyin.
İnkübasyon bittiğinde ve türetilmiş numune oda sıcaklığına ulaştığında, türetilmiş numunelere kloroformda çözünmüş beş mikrolitre yağ asidi metil esteri ekleyin. 30 metre x 250 mikrometre x 0.25 mikrometre ölçülerinde bir kılcal sütun kullanarak, kök eksüdalarının bir mikrolitresini dakikada 1.0 mililitre akış hızında bir taşıyıcı gaz helyumu ile ayırın. Enjeksiyon sıcaklığını 280 santigrat dereceye ayarlayın.
Ve transfer hattı sıcaklığını 280 santigrat derecede tutun. Fırın programını ayırma için ayarlayın. Ekstraktları ayırdıktan sonra, eksi 70 elektron voltluk bir enerjiyle elektron çarpışma modunda kütle spektrometresi yapın.
İyon kaynağı sıcaklığını 250 santigrat derecede tutun. Saniyede 12,5 spektrum hızında şarjla 50 ila 500 kütle tarama aralığına sahip tam tarama izleme modunu kullanarak kütle spektrumları elde edin. Kontrol örneğinin kromatografında 778 tepe noktası tespit edildi.
Bunlardan 314 metaboliti kütle spektrumlarına göre tanımlanmıştır. Asitler ayrıca yağ asitleri, amino asitler, organik asitler ve fenolik asitlere bölündü. Ek olarak, genellikle kök eksüdalarında bulunan bazı yaygın maddeler, pirimidinler, hidroksi pirimidinler, flavonoidler, fenoller, ketonlar, pirimidinler ve diterpenler dahil olmak üzere yonca kökü eksüdalarında da tespit edilmiştir.
Farklı DEHP tedavileri arasındaki diferansiyel metabolitlerdeki varyasyonu görselleştirmek için VIP skoruna dayalı bir ısı haritası çizildi. Kontrol örnekleriyle karşılaştırıldığında, DEHP maruziyeti 50 metabolit ve yonca kökü eksüdasının içeriğini önemli ölçüde değiştirdi. Esas olarak bazı karbonhidratlar ve düşük moleküler ağırlıklı organik asitler içerir.
Metabolik yollar analizi, DEHP'nin fotosentezin ürünü olan karbonhidratların metabolizmasını önemli ölçüde inhibe ettiğini gösterdi ve DEHP'nin yoncanın fotosentezini bir dereceye kadar baskılayabildiğini gösterdi DEHP'nin, DEHP'den gelen strese direnmeye yardımcı olan yağ asitlerinin metabolizmasını teşvik ettiği görüldü. Doğru metabolomik veri analizini sağlamak için her işlem için en azından tohum kökü eksüdaları yapılmalıdır. Diferansiyel metabolizasyonu belirleyebilir ve kirleticilerin çevresel davranışlarındaki önemli kuralları daha fazla araştırabiliriz.
Bitkiler ve daha geniş alan biyolojik topluluğu arasındaki etkileşimler çoğunlukla bu yöntem kullanılarak deşifre edilebilir.
