Bitki kallus kültürü, bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolik bozunmasının doğru, verimli ve hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için bir çözüm sunar. Bitki kallus kültürü, mikrobiyom veya mantar girişimini ve fotokimyasal bozulmayı dışlayabilir, bozulmamış bitkilerin matris etkisini basitleştirebilir, yetiştirme koşullarını standartlaştırabilir, tedavi süresini kısaltabilir ve daha az deneysel çaba gerektirebilir. Burada önerilen yöntem, farklı organik kirleticilerin mahsuller üzerindeki alım davranışı ve metabolik mekanizmaları hakkında fikir verebilir ve çevresel risk değerlendirmeleri çabaları için yararlıdır.
Başlamak için, tüm ekipmanı otoklavlayın ve tüm işlemleri UV ile sterilize edilmiş ultra temiz bir çalışma tezgahında gerçekleştirin. Vernalize tohum yüzeyini 20 dakika boyunca% 75 etanol ile sterilize edin. Steril deiyonize su ile üç kez durulayın ve tekrar% 20 hidrojen peroksit ile 20 dakika sterilize edin.
Tohumlar altı kez sterilize deiyonize su ile yıkandıktan sonra, %1 agar jeli içeren pH 5.8 olan otoklavlanmış, hormonsuz Murashige ve Skoog besiyerine ekerek aseptik olarak çimlendirin ve 15 gün boyunca 16 saat foto süre ile 26 santigrat derecede inkübe edin. 15 günlük tohum inkübasyonundan sonra, eksplantları elde etmek için fidenin hipokotil ve kotiledonunu 0,5 santimetrelik küçük parçalar halinde kesin. Eksplantları, Oxymon ve Phycocyanin ile desteklenmiş 15 ila 20 mililitre otoklavlanmış Murashige ve Skoog ortamı içeren bir Petri kabına dönüştürün ve nasırı indüklemek için karanlıkta 26 santigrat derecede üç ila dört hafta inkübe edin.
Steril bir neşter ve forseps kullanarak, ilk eksplantlardan oluşan yaklaşık bir santimetre çapındaki kallusu ayırın. Tedavi için 2, 4-dibromofenolü 10 mililitre aseptik sıvı Murashige ve Skoog ortamında çözün. Daha sonra hazırlanan 2, 4-dibromofenol çözeltisine üç gram ayrılmış havuç nasır ekleyin.
Ortamı el yazmasında anlatıldığı gibi boş kontrolde hazırladıktan sonra, tüm şişeleri karanlıkta inkübe edin. Numuneyi hazırlamak için, 0.45 mikron cam elyaf filtrelerle süzülerek 2, 3-dibromofenol işlem ve kontrol şişelerinden kallusu dikkatlice ayırın. Nasırı toplamadan önce üç kez ultra saf suyla yıkayın.
Toplanan tüm nasırları dondurarak kurutun ve 0,2 gram kurutulmuş nasırı yüksek verimli bir doku öğütücü ile 70 hertz'de üç dakika boyunca homojenize edin. Homojenize kallus ve girdap içine bir dakika boyunca 50 mikrolitre vekil döteryumlu 4-n-nanofenol eklemek için bir cam mikroşırınga kullanın. Çivili kallusa eşit oranda metanol ve su içeren çözeltinin beş mililitresini ekleyin ve 2, 4-dibromofenol ve metabolitleri çıkarmak için 30 dakika boyunca sonikleştirin.
Ekstraksiyondan sonra, süspansiyonu 8.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı pipetleyerek toplayın. Ekstraktı hidrofilik lipofilik dengeli katı faz ekstraksiyonundan veya dakikada bir mililitre akış hızına sahip HLB-SPE kartuşundan geçirin. HLB-SPE kartuşundan altı mililitre metanol geçirerek analitleri seyreltin.
Daha sonra elde edilen eluenti, enstrümantal analiz için hafif bir nitrojen gazı akışı altında bir mililitreye konsantre edin. Analiz için kolon ısıtıcı kapısını açın. Ardından, kolon girişini enjeksiyon valfine ve çıkışı kütle spektrometresinin girişine bağlayarak ultra performanslı sıvı kromatografisi kolonunu kurun.
Çözücü tüpleri A ve B'nin ucunu ilgili çözücü şişelerine yerleştirin. Numune şişelerini seri numarasına göre numune tepsilerinin ilgili yerlerine yerleştirin ve numune tepsilerini numune haznesine yeniden yerleştirin. Yazılım penceresinde, sıvı kromatogramının koşullarını düzenlemek için Enstrüman'a ve ardından Giriş Yöntemi'ne tıklayın.
MS Metodu'nu seçin ve kütle spektrum analizi parametrelerini ayarlayın. Veritabanını oluşturmak ve adlandırmak için Dosya'ya ve ardından Yeni'ye tıklayın. MS Dosyası'nı ve ardından Giriş Dosyası ve Enjeksiyon Birimi'ni seçerek yukarıda oluşturulan örnek programı yükleyin.
Dosya ve Kaydet'e tıklayarak veritabanını projenin örnek klasörüne kaydedin. Ardından, ana yazılım penceresinde Çalıştır ve Başlat'ı seçin ve Örnek Verileri Al'a tıklayın, ardından veri toplamak için örnek listeyi başlat çalışmasındaki Tamam düğmesine tıklayın. Verileri işlemek için hedef veri satırını seçin ve MS tarama kromatogramını görüntülemek için kromatogram penceresine tıklayın.
Kromatogram penceresinde, Ekran'a ve ardından TIC'ye tıklayın. DS tarama dalgasına tıkladıktan sonra, kızı kütle spektrumu taramasını almak için iz ekleyin ve Tamam'ı ekleyin. 2, 4-dibromofenol ile muamele edilmiş havuç kallus ekstraktının kromatogramı, kontrol örneklerine kıyasla sekiz farklı metabolitin varlığını gösterdi.
Ek olarak, kromatogramda ebeveyn 2, 4-dibromofenol pikinin olmaması, deneysel koşullar altında havuç kallusundaki 2, 4-dibromofenolün hızlı metabolizmasını gösterir. Ayrıca, havuç kallusunda inkübe edilen 2, 4-dibromofenol, glikoz ve amino asitlerle doğrudan konjugasyon yoluyla metabolitlerin oluşumuna yol açtı. Bitki kallusunun farklılaşmasının ve bakımının aseptik koşullar altında yapıldığından emin olmak için tüm ekipmanların yanı sıra Murashige ve Skoog ortamı da otoklavlanmalıdır.
Bu prosedürü takip eden omik yaklaşımlar, çevresel kirleticilerin net bir fitotoksik mekanik resminin oluşturulmasına izin verir.
