Bu protokol, ex vivo ürotelyal preparatta mekanik olarak uyarılmış kalsiyum olayını incelemek için bir tekniği açıklar. Tekniğin uygulanması nispeten kolaydır ve diğer doğal doku preparatlarında mekanik olarak uyarlanan kalsiyum olayını incelemek için uyarlanabilir. Kılcal camı çektirmeye yerleştirerek ve kılcal tutucu düğmelerle ayarlayarak mikropipetleri imal edin.
Cam kılcal damarı üreticinin talimatlarına göre iki adımda çekin. Isıtıcı ayar düğmesi 60'a ayarlanmış bir mikroforge kullanarak mikropipetlerin ucunu kapatın. Mesaneyi ve ötenazi farenin pelvik kemiğini açığa çıkardıktan sonra, üretrayı açığa çıkarmak için pelvik kemiği çatlatın ve üretrayı 24 gauge kateter ile kanüle edin.
Kateteri üretraya sabitlemek için 6-0 dikiş kullanın. Mesaneyi ve üretrayı toplayın ve bunları kayıt çözeltisinde yıkanmış silikon kauçuk tutucu bir pedine yapıştırın. Mesane mukozasını altta yatan kas tabakasından ince forseps ile ayırın.
Mesane mukozasını kesin ve ürotelyum 35 milimetre çapında bir doku kültürü kabının altındaki silikon elastomer ekine bakacak şekilde sabitleyin. Doku kültürü kabını, dirençli ısıtma elemanlarına sahip bir kültür çanağı inkübatörü ile donatılmış mikroskop aşamasında sabitlenmiş mesane mukozası ile monte edin. Hücre kültürü kabını, sıralı bir ısıtıcı ile 37 santigrat derecede ısıtılmış bir kayıt çözeltisi ile dakikada 1,7 mililitre hızında sürekli olarak perfüze edin.
Çift kanallı bipolar sıcaklık kontrol cihazı ile doku kabı inkübatörünün ve çözeltilerinin sıcaklığını yaklaşık 37 santigrat derecede tutun. Mekanik olarak indüklenen kalsiyum iyonu geçicilerini kaydetmek için, mikropipeti kayıt çözeltisine batırın. Parlak alan aydınlatması altında, düşük büyütmeli tarama hedefi kullanarak mikropipeti alanın merkezine taşıyın.
Mikromanipülatörü dikey düzlemde hareket ettirin ve pipeti ürotelyal dokunun yüzeyine yakın bir yere taşımak için odağı ayarlayın. Daha yüksek büyütme ve immünofloresan için uygun sayısal diyafram açıklığı ile hedefe geçin. Mikromanipülatörü ince duruma getirin ve pipeti hedef hücrenin üst kısmına yakın bir yere getirin.
Gerekirse, odağı ve pipetin konumunu ayarlayın. Elektrofizyoloji yazılımındaki stimülasyon protokolünü açın ve oynatılacak şekilde ayarlayın. Odağı ayarlayın ve veri toplamayı başlatmak için deneme yöneticisinde başlat düğmesine basın.
Bu, piezoelektrik aktüatörü tahrik eder ve deneyin görüntülerini içeren bir dosya oluşturur. Hücre uyarıldığında, floresanda bir artış gözlenir. Floresan yoğunluğunu ölçmek için, görüntü dosyasını görüntüleme yazılımında açın ve sayım ve ölçüm penceresini seçin.
Uyarılan hücreyi tanımlamak için filmi oynatın. Poligon aracını seçin ve dürtülen hücrenin sınırlarına bir yatırım getirisi çizin. Hesaplama penceresine gidin, yoğunluk profilini seçin, ölçümü fazla mesai, sonuçları ortalama, arka plan çıkarma işlemini yok olarak ayarlayın ve ardından execute (yürüt) düğmesine basın.
Ortalama floresan yoğunluğu zamanla hesaplanacaktır. Yoğunluk profili verilerini dışa aktarmak için, yoğunluk profili sonuçları penceresindeki Excel simgesine tıklayın ve bilimsel grafik ve veri analizi yazılımını kullanarak veri analizi gerçekleştirin. Bu çalışmada, şemsiye hücre, mekanik olarak uyarılmış kalsiyum geçicilerini değerlendirmek için dürtülmüştür.
10 saniyede çekilen görüntü, bir şemsiye hücresinin üzerine yerleştirilmiş uyarıcı pipetin floresan bir görünümünü gösterir ve bir floresan kalsiyum sensörü GCaMP5G'yi ifade eder. Kalsiyum sensörünü eksprese eden şemsiye hücresinin mekanik olarak uyarılması, floresan emisyonunda hızlı bir artışın ardından bir deformasyona neden olur. Grafik, birkaç hücre için zamanın bir fonksiyonu olarak çizilen floresan yoğunluğundaki bir değişikliği göstermektedir.
Dürtme, floresan kalsiyum sensörü ile dönüştürülen çoğu şemsiye hücresinde kalsiyum tepkisi uyandırır. En önemli adım, mesane ve üretranın toplanması, ardından silikon kauçuk tutucu pedine yapıştırılmasıdır. Mesane mukozasını altta yatan kas tabakasından ayırırken doku hasarından kaçının.
Burada tarif edilenler gibi görüntüleme yöntemleri, mekanoyla aktive olmuş kanalların doğal ortamlarında değişiklikleri nasıl gönderdiğine ve fizyolojik tepkiler ürettiğine dair benzersiz bir fikir verebilir.
