This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

Içi Lateks Ayıraçların hazırlanması 1. <ol><li> Glisin tamponlu tuz hazırlanması (GBS) <ol><li> 1.5 g glisin, 11.7 g sodyum klorid ve 200 ml&#39;lik bir cam şişeye damıtılmış su, 100 ml ilave edilir. </li><li> Manyetik bir karıştırıcı kullanarak çözmek üzere karıştırılır. </li><li> Bir ölçme silindiri 500 ml karışımı aktarın ve 200 ml lik bir toplam yapmak damıtılmış su ilave edilir. </li><li> , 200 ml&#39;lik bir cam kaba geri çözeltisini pH&#39;ı kontrol edin ve 5 M sodyum hidroksit ile 8.2 olarak ayarlanır. NOT: Sodyum hidroksit aşındırıcı, kişisel koruyucu ekipman giyin. </li><li> Filtre 250 ml&#39;lik preautoclaved vidalı kapaklı cam şişeye 0.22 mcM filtreleri ve çok sayıda 60 ml şırınga kullanarak çözüm sterilize. </li><li> Oda sıcaklığında saklayın. </li></ol></li><li> % 0.2 büyükbaş hayvan serum albümini ile GBS hazırlanması <ol><li> 200 ml&#39;lik bir cam kabın, büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) tozunun 0.2 gramı ve GBS 100 ml ilave edilir ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak eritmek için karıştırın. </li><li> Filtre250 ml&#39;lik bir preautoclaved vida kapaklı bir cam şişeye çok sayıda 60 mi şırıngalar 0.22 uM filtre yoluyla çözeltinin sterilize edin. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Lateks reaktif hazırlama <ol><li> Alt mikrofuge&#39;ye tüp yuvarlak bir 2 ml etiketleyin. Not: tüpler yuvarlak tabanlı bir antikor bağlanmasını etkileyebilir parçacık çökmesini en aza indirmek için kullanılır. </li><li> Steril uçları işlemi, mikrofüj tüpüne GBS 975 ul ile P1000 pipet kullanarak, daha sonra lateks tepkime maddesi (yani, havuz, grup, tip veya faktör) hazırlanan uygun pnömokok antiserumu 25 ul ekle. Karıştırmak için beş kez ters çevirin. </li><li> Steril fizyolojik salin 1080 ul lateks partikülleri 120 ul ekleyerek polistiren lateks parçacıkları 1:10 seyreltin. NOT: Bu daha fazla hacimlerde yapılabilir, ancak lateks reaktifler üretilmiş taze her yapılmalıdır. </li><li> 1 (adım 1.3.3 hazırlanan) 01:10 lateks süspansiyonu 1.000 ul ekleyin,000 ul 1:40 antiserumu süspansiyonu (aşama 1.3.2 hazırlandı). Karıştırmak için beş kez ters çevirin. </li><li> Yavaş dönen bir tekerlek üzerinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir (örneğin, 38.5 cm çapa sahip bir tekerlek için 4 rpm) 2 saat karıştırıldı. </li><li> 1,100 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça steril tuzlu 2 ml pelletini. </li><li> 1,100 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı atın ve GBS 1 ml ekleyin ve hafifçe pelletini. </li><li> Etiketli bir 5 ml lateks süspansiyonu pipetle tüp kapatıldı vida. GBS başka 1 ml ekleyin. </li><li> GBS (pH 8.2) (adım 1.2 hazırlandı) (ağ / hac)% 0.2 BSA ihtiva eden 2 ml ilave edilir. % 10 bir koruyucu olarak sodyum azid (ağ / hac) çözeltisi 40 ul ekle. NOT: Sodyum azid solunması halinde tehlikeli olduğunu ve bir cilt ve göz tahriş edicidir. Bu inhalasyon yoluyla temas riskini en aza indirir gibi, toz halinde yerine hazırlanmış bir% 10 çözelti satın almak için arzu edilir. Eldiven, bir de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar (Bu reaktifi işlerken d gözlüğü) giyilmelidir. Ayrıntılar için Malzeme güvenlik veri sayfasına bakın. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın lateks reaktif ile gerçekleştirilebilir. </li></ol></li><li> Negatif kontrol lateks tepkin maddesi hazırlanması <ol><li> Alt mikrofuge&#39;ye tüp yuvarlak bir 2 ml etiketleyin. Not: tüpler yuvarlak tabanlı bir antikor bağlanmasını etkileyebilir parçacık çökmesini en aza indirmek için kullanılır. </li><li> Steril uçları işlemi, mikrofüj tüpüne GBS 975 ul ile P1000 pipet kullanarak, daha sonra 25 ul normal tavşan antiserumu ilave edin. Karıştırmak için beş kez ters çevirin. </li><li> Adımlarda devam yukarıdaki 1.3.10 için 1.3.3 </li></ol></li></ol> 2. Kalite Kontrol Lateks Ayıraçların (QC) <ol><li> Oda sıcaklığına kadar lateks tepkin maddesi getirin. Kullanmadan hemen önce, yavaşça Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek lateks tepkin maddesi karışımı. </li><li> Bir cam mikroskop lamı üzerine 15 ul pipetleyerek autoagglutination için ayıraç edin ve adımları 4.7 ve aşağıda 4.8 gibi devam edin. Hayır olmalıLateks partiküllerin gglutination. Reaktif beyaz ve pürüzsüz görünmesi gerekir. </li><li> Düşük geçiş pnömokok izolatı bir paneli karşısında reaktif edin. Izolatların paneli &#39;hedef&#39; serotipin izolatlarınının (reaktif madde için spesifik serotip test ediliyor) ve &#39;hedef olmayan&#39; serotiplerini (normalde çapraz olmamalıdır diğer Serotiplerin izolatlarınının içermelidir 3. adımda hazırlanan taze yetiştirilen kültürler kullanın ) tepkin maddesi ile reaksiyona girer. QC geçiren Her bir lateks tepkin maddesi için, her bir hedef ve hedef olmayan serotip en az bir izolat içerir. Serotipte sadece bir hedef ya da hedef olmayan serotip, Test, iki farklı izolat ise. NOT: Test paneli invazif hastalık ve / veya tip kültür koleksiyonlarından nadir bazıları her çeşitli serotip izole, içermelidir. Genellikle (veriler gösterilmemiştir) serotipi için daha fazla çaba gerektirir gibi ve dolayısı ile de gücü o test bazı taşıma izole dahil etmek tercih edilirreaktifler f ve reaktifler invaziv ve taşıyıcısını izolatlarının hem serotiplendirme olası yeteneğine sahip olmasını sağlamak. </li><li> Hedef ve hedef olmayan pnömokok lateks reaktiflerin Test devam adımları 3 ve 4 de tarif edilen yönteme göre izole edildi. </li><li> Sonra en az yılda daha sonra üretim zamanı ve kalite kontrol reaktifleri. NOT: Bir reaktif QC geçemezse, toplu atılır ve yeni bir hazırlama yapılmalıdır. Tekrar QC arızası durumunda biz reaktifler Ortika ve ark. 2013 8 ve aşağıdaki tartışmada tarif edilen alternatif yöntemler kullanılarak üretilebilir önerilir. </li></ol> Serotiplemeye Pnömokok Kültürler 3. hazırlanması <ol><li> Steril bir spiral kullanarak pnömokok tek bir koloni seçin Primer inokulum plaka yüzeyinin yaklaşık üçte birini kapsayan ve böylece sağlam bir seçici olmayan kan agara bunu izole ve çizgi. Tek koloniler için Streak. NOT: defibrinleştirilmiş at veya koyun kanından hazırlanan levhalar uygundur; ama insan kanı veya Sitratlı hayvan kanı ile hazırlanan kan plakaları değildir. </li><li> % 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C&#39;de levha O / N inkübe edin. </li><li> Saflık plaka üzerinde büyüme dikkate ve tipleme için yeterli gelişme olduğunu değerlendirmek. Not: pnömokok izolatı saf bir kültürü tipleme için gereklidir. Levha yüzeyi yaklaşık olarak üçte birini kaplayan deneyim konflüent, veya yapışık yakınındaki büyüme genellikle serotipleme tamamlamak için yeterlidir. Pnömokok kültürler autolysis eğilimli olabileceğinden, tipleme için hazırlanan kültürler altkültür, 24 saat içinde test edilmelidir. Serotipleme başlamadan önce en fazla 15 20 dakika kuluçka kültür plaka almayın. </li></ol> 4. İletken Lateks Aglütinasyon Serotipleme <ol><li> Yaklaşık için oda sıcaklığında bunları buzdolabı tüm reaktifler lateks ayırın ve30 dakika nerdeyse. Kullanmadan hemen önce, yavaşça reaktifleri karıştırmak için tüpler ters. </li><li> Bir mikroskop lamı etiketleyin. </li><li> Mikroskop lamı üzerine negatif kontrol lateks reaktifi 15 ul yerleştirin. </li><li> Döngü yaklaşık yarısı dolu olacak şekilde steril tek kullanımlık 1 ul döngü kullanarak pnömokok kültürünün bir süpürme alır. </li><li> Hafifçe negatif kontrol lateks tepkime maddesi damla yakın sürgü yüzeyine inokulum smear. Inokulum cam slayt üzerinde görünür olmalıdır. </li><li> Hızlı ve iyice döngü kullanarak negatif kontrol lateks ayıraç içine inokulum karıştırın. Damla başlangıç ​​boyutundan daha fazla yaymak değil emin olun. </li><li> Iki ucunda tutarak, slayt Pick up. Ileri ve geri 1 dakika için slayt sallayın. Yavaş yavaş hareket sıvı tutmak ve damla büyüklüğü artmaz emin olmak için özen gösterin. NOT: Alternatif bir tabak rocker kullanın. </li><li> Makroskopik aglütinasyon (yani, tarafından gözlemlemekçıplak göz) ve siyah bir arka plan karşı süspansiyon takas. </li><li> Negatif kontrol lateks reaktifi hiçbir aglütinasyonunu gösterir veya takas yukarıdaki adımları 4,1-4,8 olarak negatif kontrol lateks reaktifin test lateks reaktifleri yerine, kültürünü test devam edin. Taze bir döngü, her zaman kullanılmalıdır. Havuzları ile başlayan lateks reaktiflerin test ile devam edin. </li><li> Bir pozitif test elde edilene kadar arka arkaya &#39;Havuz&#39; lateks reaktifleri her test edin. NOT:. Örneğin, ilk slaytta üç büyük olasılıkla havuzları için test özellikle serotip (yerel insidansını yansıtmak için &#39;tur&#39; yapılabilir havuzlarının test sırası bir pozitif reaksiyon elde değilse, o zaman testi ) ve böylece pozitif bir tepki elde edilene kadar, bir sonraki üç ikinci slayt üzerinde kalan havuzları muhtemelen. Bu, en yaygın serotipler gereken zamanı en aza indirmek ve reaktifler, birinci test edilmesini sağlamaktadır. </li><li>Antiserumlar üreticinin anahtarını kullanarak olumlu havuzunda temsil bireysel hangi antiserumlar belirler. </li><li> Yukarıdaki adımları 4,1-4,8 olarak &quot;grup&quot; ya da &quot;türü&quot; belirlemek için ayrı ayrı pozitif havuz içinde yer alan bir gruba ya da türlerinin her biri test edin. </li><li> Antiserumlar üreticinin anahtarına referans ile bu sonuç belirler. Bir &#39;tür&#39; tespit edilirse (örneğin, serotip 5), daha sonra başka test gerekli ve bu sonuç kaydedilir. </li><li> &#39;Grup&#39; tespit edilirse (örneğin, grup 19), daha sonra test edilecek faktörleri belirlemek için üreticilerin anahtarına bakın. Bireysel &#39;faktörü&#39; lateks reaktifleri ile teste devam ve son serotipik (örneğin, serotip 19B) belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Lateks aglütinasyon pnömokok tipleme için basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Ticari pnömokok lateks aglütinasyon reaktifler kullanılabilir, ancak şu anda bilinen tüm pnömokok 10,12 serotipleri ayrım yoktur. Ancak, lateks aglütinasyon maddeleri kolayca belirli pnömokok kapsüler antigenlere karşı ortaya çıkan anti-serumlar kullanılarak satın içerisinde imal edilebilir. Burada tarif edilen yönteme göre, antikorlar pasif lateks aglütinasyon reaktif bir set yapmak için lateks parçacıkları eklenir. Pnömokok polisakkarit kapsül 18,19 izole üzerinde lateks partiküllere bağlı spesifik antikorların antijenlere taktığınızda pozitif lateks bir reaksiyon oluşur. Antikorlara bağlı lateks partikülleri spesifik bir antikor-antijen reaksiyonu, büyütme olmadan gözlemlenmesini sağlar. Lateks aglütinasyon yüksek kapasiteli laboratuvarlar için uygun bir yöntemdirkaynak fakiri ayarları için de d. Lateks aglütinasyon yöntemi önemli avantajları hiçbir özel ekipman testi gerçekleştirmek için gerekli olduğunu vardır, reaktifler 4 ° C&#39;de 8 de depolandığında en az 2 yıl raf ömrü var ve bu, basit, ucuz ve hızlı olduğunu gerçekleştirmek için. Lateks kümelenme bir pnömokok izolatı serotip yaklaşık 10 dakika sürer, ve dört adete kadar lateks reaktifler, bir slayt üzerinde paralel olarak test edilebilir. Serotiplerin sıklığı önemli bir epidemiyolojik ayarı için bilinen Ayrıca, eğer, deneme testi 17 kapsül şişme deneyi benzer yaygın olan serotipleri içeren havuzlara başlayarak mermi gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, bir serotip belirlemek için gereken test sayısını en aza indirir. Yöntem ayrıca, farklı operatörler arasında yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu (veriler gösterilmemiştir). Lateks aglütinasyon serotipleme bir dezavantajı, reaktif maddeler üreten yaklaşık 4 saat alarak, zaman tüketen olmasıdır; Birden fazla tepkili olmasına rağmenNTS kolayca paralel olarak üretilebilir. Ayrıca, bazı antijenler, bazı anti-serumlar ile çapraz tepkime ile sonuçlanan farklı pnömokok serotipleri ortak olan (örneğin, serotip 29, 42, Grup 35). (Genellikle daha sorunlu çapraz reaksiyona giren antikorları uzaklaştırmak için absorplanmıştır edilir), ticari antiseranın ve ek reaksiyon tabloları kullanarak mevcut olan serotip ayırt etmek için üretici tarafından sağlanan Ancak, bu çapraz reaksiyonlar iyi karakterize edilir. Antikorlar lateks parçacıkları üzerinde düzgün hizalanmış değilse de geçebilir lateks reaktifleri tepki; Bu QC başarısızlık olarak algılanır. Bizim deneyim, titiz QC piyasada mevcut antiserumlar üretim için kullanıldığında bile, bu yöntemin başarısı için esastır. QC reaktif başına yaklaşık olarak 15 dk ve yukarıda tarif edildiği gibi izole edilen uygun QC bir dizi dayanır. Burada tarif edilen metot, bir pozitif reaksiyon de wi elde reaktifler ile sonuçlanırtest süresi ince. Bizim tecrübelerimize göre, yanlış pozitif (veriler gösterilmemiştir) pratikte nadirdir. Arasıra yanlış negatif reaksiyonlar gözlenir; Genellikle, bu, belirli bir antiserum ile bilinen sorunlar (örneğin serogrup 6 izolatı Havuz B antiserumu ile reaksiyona girmemekte) veya izolatı ile kapsül ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile ilgilidir. Yanlış pozitif veya negatif reaksiyon, bir kör uç &#39;sonucu verir çoğu durumda imalatçı tarafından sağlanan serotip algrorithm kullanılması da önemlidir. Reaksiyonları yorumlamak zor olduğunda bu gibi durumlarda, ve biz bu kapsül şişme deneyi reaksiyonu gibi alternatif bir yöntemle tekrar-test ve / veya testini öneririz. Bazı sorun giderme bazen tatmin edici lateks reaktifleri yapmak için gereklidir. Burada açıklanan yöntem, antikor pasif adsorpsiyon 15,19 ile, lateks parçacıkları bağlanmış, böylece kritik bir değişkendir kadar iyi belirler ikinci antikor konsantrasyonu, birLateks partiküllerin yüzeyi kapalı ve antikor, aktif alanlarının 15,20 sonraki hizalamasıdır. Yetersiz veya aşırı antikor, lateks partiküllerin de bağlı olduğu Sonuç olarak, eğer, antikor-antijen reaksiyonu optimum olmaz ve tatmin edici reaktifler 15,20,21 üretilebilir. Antikor titreleri antiserumların farklı partiler arasında değişir gibi, dilüsyonlarının standart bir dizi kuyu 8 gerçekleştirmek reaktifler üretmek olmayabilir. Yararlı bir başlangıç ​​noktası antiserumun bir 1:40 seyreltme kullanımı ve bu başarılı değilse, daha da antiserumu seyreltin. Bizim tecrübelerimize göre bu genellikle sorunu 8 giderir. Vakaların küçük bir sayıdaki belirteçler hedef izolatları ile test edildiğinde süspansiyon takas eşlik etmediği zayıf aglütinasyon gösterebilir. Reaktifin kalitesini geliştirmek değil, ama tatmin edici reaktifler genellikle santrifüj ihmal ederek üretilebilir ve yıkama adımları 8,22 antiserumu seyreltilmesi Bu durumda </sup&gt;. Antikor kaplı lateks parçacıkları çok farklı mikropların 15,20 tespiti, kimlik veya tipleme için tanısal mikrobiyoloji yaygın kullanılmaktadır. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, diğer amaçlar için lateks tepkin maddeleri hazırlamak için uygun olabilir, Resim uygun antiserumlar kullanılabilir ve yeterli kalite kontrol prosedürleri kabul edilir.

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) beş yaşın altındaki çocuklarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni eski dünya çapında, özellikle kaynak fakir ayarlarında 1,2,. Zatürree, sepsis gibi hayatı tehdit eden durumlara lokalize enfeksiyonlardan Pnömokok hastalığı aralıkları ve 1,2 menenjit. Pnömokokların fazla 90 serotip tespit onların kapsül polisakkarit 3 farklılıklara dayalı olmuştur. Şu aşılar kapsüler polisakkarit hedef ve invaziv hastalık 4 neden önemli serotipten koruma sağlar. Pnömokok izolatlarının serotiplendirme taşıma ve hastalık üzerine aşılamanın etkisini değerlendirmek yanı sıra geniş epidemiyolojik bilgiler 5,6 sağlanması için önemlidir. Pnömokok tipleme için geçerli &#39;altın standart&#39; yöntemi kapsül şişme deneyi testi, ama zaman alıcıdır ve perfo bazı beceri gerektirirrm 7. Lateks aglütinasyon Dünya Sağlık Örgütü tarafından 7 alternatif bir serotipleme yöntemdir. Lateks aglütinasyon gerçekleştirmek için hızlı ve basit, ve dünya çapında 8-11 birçok laboratuvarda kullanılmaktadır. Önemli olarak, lateks aglütinasyon pnömokok serotipleme 10,12-14 için kapsül şişme deneyi test etmek için karşılaştırılabilir kesinliği göstermiştir. Genel olarak, bu yöntem, kaynak yoksulluğu yanı sıra yüksek miktarda laboratuarlar için idealdir. Lateks aglütinasyon reaktifler (&#39;lateks reaktifleri&#39;) lateks parçacıkları 15 antikorların bağlanması ile oluşturulur. Pozitif bir reaksiyon olarak, bu etiketlenmiş parçacıklar, spesifik bir antijenin varlığında tutunurlar. Ticari lateks reaktifleri Serotiplerin sınırlı bir aralığı için mevcuttur. Lateks reaktifleri aynı zamanda ticari olarak temin edilebilen anti-serumlar kullanılarak 10 in-house hazırlanabilir. Antiserumlar karışımları (&quot;havuzlar&quot;) yanı sıra, pnömokokkal s özgü antiserumlarerogroups (örneğin, grup 19), tek tek serotip (örneğin, serotip 5), ve belirli antijenlere karşı (&quot;faktör&quot;, örn., serotip 19A tanıyan faktörü 19c) ayrıca, grup içinde serotipleri tanımlanması için 16 mevcuttur. Bu yazıda, lateks parçacıkları için ticari olarak temin edilebilen antiserumlar pasif ucunu kullanarak lateks reaktiflerin üretilmesinde adımları açıklamaktadır. Bu yöntemin Kalite kontrol (KK) yönlerini tarif edilmiştir ve pnömokok tipleme için lateks reaktiflerin kullanımı için bir protokol dahildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Lateks partikülün tip-spesifik antikor pneumococcus un kapsülünün bağlanır ve buradaki antikor etiketlidir partikülleri aglütinasyonu 15 gelişir olduğunda pozitif bir lateks reaksiyon meydana gelir. Şekil 1A arka görünür aglutinasyon testi ve temizleme ile karakterize edilen bir pozitif reaksiyonunu göstermektedir süspansiyonu. Negatif bir reaksiyon yumuşak ve beyaz (Şekil 1B), kalan lateks aglütinasyon reaktif süspansiyonu ile karakterize edilir. Bir pozitif reaksiyon, bir dakikalık bir zaman süresi içinde (yaklaşık 20 saniye içinde, genellikle tespit edilebilir) sonuna kadar dikkat edilmesi gerektiğini, böylece ayıraçlar optimize edilmiştir. Biz 1 dakikalık bir zaman aralığından sonra tepkilerini okuma önermiyoruz. Çok nadiren, reaksiyonlar arka süspansiyon temizleyerek eşliğinde, ya da hiç plan temizlenmesi ile kılçıklı &#39;görünmez bir damla kenarında zayıf aglütinasyonunu görüntülemek (veriler gösterilmemiştir). Bunlar çoğu gibi<html> ly olumsuz tepkiler. Bu tür durumlarda, retesting ve / veya başka bir serotip yöntemi (örneğin kapsül şişme deneyi tepkime karışımı 17) ile daha ileri araştırmalar önerilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Pozitif ve negatif lateks aglütinasyon reaksiyonları. Bir pnömokok hazırlıklar pozitif reaksiyon (A) veya olumsuz bir tepki (B) gösteren lateks aglütinasyon maddesi ile karıştırılır izolat. Arka temizlenmesi eşlik Yapıştırma .Orada negatif kontrol lateks tepkin maddesi ya da bir negatif test reaksiyonu (B) görünür bir aglütinasyon olan pozitif reaksiyon, (A) olarak görülmektedir. Fotoğraf 8 izni ile kullanılır.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Lateks aglütinasyon testi Streptococcus pneumoniae serotip için, basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir ve aynı zamanda yaygın tanı mikrobiyoloji uygulanmıştır. Bu el yazması lateks aglütinasyon reaktif, kalite kontrol prosedürlerinin içi üretim ve pnömokok serotipleme Bu tekniğin uygulanması anlatılmaktadır.

Kapsüler Serotipleme<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Lateks Aglutinasyon tarafından

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K Görüntüleme.  Murdoch Childrens Research Institute.  Lateks aglütinasyon testi Streptococcus pneumoniae serotip için, basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir ve aynı zamanda yaygın tanı mikrobiyoloji uygulanmıştır. Bu el yazması lateks aglütinasyon reaktif, kalite kontrol prosedürlerinin içi üretim ve pnömokok serotipleme Bu tekniğin uygulanması anlatılmaktadır. 

Video: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Of kapsül Serotipleme<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Kapsül şişme deneyi kullanarak Reaksiyon

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Immünkompetan Kemirgenler bir Sağlam Pnömoni Modeli karşı antibakteriyel etkinliğini değerlendirmektir<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;<i&gt; H. influenza</i&gt;<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ya da<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...