Çentik sinyali, metazoanlarda gelişim sırasında sülfat kararını ve desenini kontrol eder. Çentik ligand delta-D'yi etiketlemek ve gelişmekte olan zebra balığı ön beynindeki radyal glia progenitörlerinde endositik trafiğini görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirdik. Zebra balığı gizli beyin ventrikül enjeksiyonu, gelişmekte olan beyin ventriküllerini kaplayan miyototik radyal glia progenitörleri tarafından yüksek verimlilik ve uzun süreli etkilerle seçici Anti-Dld-Atto-647N alımını sağlar.
Bu protokol, farklı gelişim aşamalarında kullanılan diğer farmakolojik veya genetik pertürbasyonlarla kolayca birleştirilebilir ve muhtemelen yetişkin beynine ve insan pluripotent kök hücresinden türetilmiş 2D veya 3D beyin organoidlerine uyarlanabilir. Döllenmiş embriyoları ürettikten ve 18 ila 20 saat boyunca inkübe ettikten sonra, inkübatörden çıkarın. Onları bir epifloresan mikroskobu altında, önce beyaz ışık kullanarak 20 kat büyütmede gözlemleyin.
Cam pipet kullanarak mikroskop altında bulutlu veya yırtılmış görünen ölü embriyoları atın. Ardından floresan lambayı açın ve mikroskobun RFP filtre ayarını seçin. Güçlü kırmızı floresansı olan embriyoları seçin ve yumurta suyu ile yeni bir kaba aktarın.
Şimdi embriyoları beyaz ışık altında iki ince forseps ile manuel olarak dekoryonlayın. Koryonu bir çift forseps ile tutun ve diğer forsepslerle koryonda bir yırtılma yapın. Forsepsleri kullanarak gözyaşını dikkatlice açın ve embriyoyu diğer forsepslerin uçlarıyla hafifçe iterek embriyonun geçmesi için yeterince büyütün.
Mikroenjeksiyondan önce hızlı bir durulama için dekoryonlanmış embriyoları taze embriyonik ortama sahip yeni bir Petri kabına aktarın. Bir çektirici üzerine ince enjeksiyon iğneleri çektikten sonra, iğnenin ucunu stereo diseksiyon mikroskobu altında forseps ile açın. Ucun çapını 10 mikrometre civarında ve konik açısını 30 derece civarında yapın.
Şimdi 0.5 mikrolitre anti-Dld antikorunu, iki mikrolitre anti fare L G Atto-647N antikoru ile karıştırın, konjuge etmek için beş ila 10 kez pipetleyin ve oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, antikor karışımına 2.5 mikrolitre bloke edici tampon ve 0.5 mikrolitre% 0.5 fenol kırmızısı ekleyin ve karışımda kalan konjuge edilmemiş antikorları bloke etmek için pipetleme ile karıştırılır. Daha sonra, embriyo ortamında% 1 düşük erime noktası agarozu hazırlayın.
Agaroz içeren karışımı, karışım şeffaflaşana kadar 70 santigrat derecede ısıtın. Agaroz çözeltisini alıntıladıktan sonra, onları 40 santigrat derecede bir ısı bloğunda tutun. Embriyoyu% 1 düşük erime noktası agaroz içeren tüpte üç saniye boyunca durulayın.
Her embriyoyu ayrı ayrı monte etmek için embriyoyu ters çevrilmiş plastik Petri kabı kapağına ayrı ayrı agaroz damlalarıyla yerleştirin. Embriyoları agarozun içine yanal olarak düz bir şekilde yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bu pozisyonu koruyun. Agarozdaki tüm monte edilmiş embriyoları yumurta ortamı ile örtün.
Gömülü embriyoları stereo mikroskop altına koyun ve agarozu yumurta suyuyla örtün. Hava basıncı enjektörünü mikro manipülatörlerle ayarlayın ve mikroskoplara yakın yerleştirin. Hava kaynağı olarak yüksek basınç altında gaz halinde azot içeren çelik gaz tüpünü kullanın.
Embriyolar agaroza monte edildikten sonra, gaz valfini açın. Mikro enjektörün ön doldurma modülünü kullanırken, hazırlanan cam iğneyi mikro manipülatöre iki mikrolitre antikor karışımı ile önden yükleyin. Şimdi giriş basıncını inç kare başına 80 ila 90 pound ve enjeksiyon basıncını inç kare başına 20 pound olarak ayarlayın.
Mikroskop altında bir mikrometre kullanarak enjeksiyon hacmini kalibre edin. Ayar süresi süresini, iğne açıklığının boyutuna göre 10 ila 120 milisaniye arasında ayarlayın. Her enjeksiyon darbesini iletmek için rakete dokunun ve her teslimatın enjeksiyon hacmini dört ila beş nanolitreye ayarlayın.
Daha sonra mikro enjeksiyon iğnesinin ucunu arka beynin dorsal çatı plakasından, rondimer sıfır-bir menteşe noktasının arkasından geçirin ve beyin dokusuna çarpmadan yaklaşık 10 nanolitre antikor karışımı enjekte edin. Beyin ventrikülünde kırmızı sıvıların akışı gözlendi. Enjeksiyondan sonra, mikro manipülatörün düğmesini döndürerek iğne ucunu embriyodan hızlı bir şekilde çıkarın.
Başarılı bir enjeksiyon için, enjekte edilen karışımın kırmızı boyası, etraftaki agaroza sızmadan beyin ventrikülünde stabil bir şekilde kalır. Montaj plakasını mikroskop altında hareket ettirerek başka bir monte edilmiş embriyoyu tekrarlar için uygun bir konumda bulun. Altı ila sekiz embriyo enjekte ettikten sonra, embriyoları gömülü agarozdan serbest bırakmak için agarozu mikrocerrahi bir bıçakla soyun.
Mikro enjekte edilen embriyoları 30 mililitre embriyo ortamına sahip taze bir kaba aktarın ve sonraki adımlar için oda sıcaklığına yerleştirin. 30 dakika sonra, seçilen embriyoları 10 mililitre embriyo ortamına aktarın. Embriyoları monte etmek için, tüpte aynı konsantrasyonda trikan içeren% 0.8 düşük erime noktası agarozu hazırlayın.
Enjekte edilen embriyoları üç saniye boyunca sıcak agaroza batırmak için bir cam pipet kullanın. Daha sonra embriyoları hemen aynı cam pipetle agarozdan çıkarın ve embriyoları tüpten bir damla agaroz ile 35 milimetre cam tabanlı kültür kaplarının ortasına yerleştirin. Embriyonik beynin dorsal tarafını cam tabana mümkün olduğunca yakın tutmak için embriyoları bir lif probu veya yükleme ucu ile nazikçe yönlendirin.
Agaroz yavaş yavaş katılaştıkça embriyoyu kıvrılmadan uzatmak için embriyo pozisyonunu yavaşça çevirin. Daha sonra, cam alt kabı ters çevirerek embriyo pozisyonunu kontrol edin. Doğru şekilde monte edilmiş embriyolara sahip tüm dorsal ön beynin mikroskop altında görülebildiğinden emin olun.
Embriyoyu örtmek için trikan içeren iki ila üç mililitre 28.5 santigrat derece önceden ısıtılmış embriyonik ortam ekleyin. Çanağı konfokal mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına uygun şekilde yerleştirin ve görüntüleme odasının sıcaklığını 28.5 santigrat dereceye ayarlayın. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır.
Atto-647N enjekte edilen embriyolar beyin ventrikülünde arka plan floresansı gösterdi. Anti-Dld-Atto-647N enjekte edilen zebra balığı embriyoları, gelişmekte olan ön beynin çoğu hücresinde büyük miktarlarda içselleştirilmiş floresan parçacıkları gösterdi. Zaman atlamalı görüntüleme, hücre bölünmesi sırasında hücre içi Anti-Dld-Atto-647N endozomlarının hareketini gösterdi.
Çoğu mitotik radyal glia progenitörleri, anti-Dld-Atto-647N endozomlarının iki yavru hücreye anterior veya posterior asimetrik ayrışmasını gösterdi. Asimetri, anafazın sonuna doğru stabilize oldu ve daha sonra kızı hücreler tarafından çentik sinyal endozomlarının asimetrik kalıtımına neden oldu. İğnenin doğru yerde gizli marka ventriküle yerleştirildiğinden emin olun ve mikroenjeksiyon sonrası herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
Çentik delta sinyalizasyonunun etiketlenmesine ek olarak, protokol, hücre dışı alana iyi bir antikor mevcutsa, benzer stratejiler kullanarak diğer membran proteinlerini veya hücre dışı proteinleri etiketlemek için de geçerlidir.
