Bu protokol, araştırmacının karaciğer hastalığının fare modellerinde safra yolu gelişimini ölçmesini sağlar. Ayrıca safra yolu gelişimi üzerinde genetik değiştiriciler etkilerinin değerlendirilmesi için izin verir. Bu tekniğin avantajı, safra yolu gelişiminin doğrudan değerlendirilmesi için basit, hassas ve nicel bir yöntem olmasıdır.
Başlamak için, cilt forceps tarafından gergin düzenlenen ile, bir ötenazi faregöğüs kafesi altında yaklaşık bir inç enine kesi yapmak için küçük makas kullanın. Karaciğerin tüm ventral yüzeyini açığa çıkar. Dikkatle karın diğer organlara karaciğer bağlayan ligamentler ile kesmek için küçük makas kullanın.
Sonra, bağırsak tan karaciğer ayırmak için ortak safra kanalı ile kesti. Safra kesesi tutun ve dikkatle karaciğer kaldırın. Hemen 50 mililitrelik bir tüp% 4 paraformaldehit ile dörtte üçü dolu yerleştirin.
Karaciğer dokusunu onarmak için, 48 saat boyunca 4 santigrat derecede %4 PFA'da kuluçkaya yatırın. Etanol yıkar bir dizi sonra, oda sıcaklığında 30 dakika her üç kez temizleme maddesi ile karaciğer yıkayın. Gömmeye başlamak için, bir doku kalıbında bir doku kasetini 30 dakika boyunca parafin balmumu ile önceden ısıtılmış olarak 60 dereceye kadar yıkayın.
Sonra, dörtte üç yükseklikte parafin balmumu ile doku kalıbı doldurun ve 60 santigrat derece bir ısıtma bloğu üzerinde tutmak. Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kalıba karaciğeryerleştirin. Isıtma bloğundan kalıbı dikkatlice çıkardıktan sonra, kasetin üst kısmını kalıba yerleştirin.
Sıcak sıvı parafin ile kapalı ve bir gecede oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Kalıp karaciğer bloğu çıkardıktan sonra, beş mikrometre bölümleri yapma, karaciğer yüzeysel sırt tarafında kesit başlamak için bir mikrotom kullanın. Bölümlerin yıkıntılı veya katlanmış olmadığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu altındaki yüzeysel bölümleri kontrol edin.
İmmünohistokimya için slaytları işlemek için, analiz edilecek genotip başına bir slayt seçin ve ksilen, %100 etanol, %95 etanol ve son olarak %70 etanol ile 15 dakika yıkayın. İyonize sudaki kaydırağı yıkadıktan sonra Tris tabanlı yüksek pH antijen alma çözeltisine batırın. Sonra, inç kare başına 10 kilo üç dakika boyunca bir düdüklü tencerede basınç altında ısıtın.
Kaydırağı oda sıcaklığına kadar soğuttunktan sonra, slayttaki bölümleri anahatlamak için bir PAP kalem kullanın. PBS Tween ile yıkandıktan sonra, kesit başına 100 mikrolitre bloklama çözeltisi ekleyerek doku bölümlerini bloke edin ve bir saat boyunca dört derece santigrat derecede inkübasyon kaplayın. Her bölüme üç ana antikor içeren seyreltilmiş antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini uygulayın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Slaytları yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca hem ikincil antikorlar hem de kuluçka içeren ikincil antikor solüsyonunun 100 mikrolitresini ekleyin. Son olarak, montaj ortamı ve slaytlara bir kapak kaymauygulayın. Her bölümün 1x yakınlaştırma20x görüntü almak için bir floresan mikroskop kullanın.
Karaciğer boyunca her portal ven görüntülenmiş olduğundan emin olun. Aşağıdaki sütunları içeren bir elektronik tablo oluşturun: Hayvan/Örnek numarası, Resim numarası, portal damar sayısı ve safra yolu sayısı. Her görüntü için görüntü başına portal damar sayısını belirleyin ve kaydedin.
Daha sonra, her görüntüde patent safra kanalları tanımlamak, tanımlanabilir bir lümen çevreleyen kolanjiyositvarlığı ile. Bu yapılar farklı olmalı ve mezenkim ile diğer geniş spektrumlu sitokkeratin-pozitif hücrelerden ayrılmalıdır. Bu tekniğin bir ana sorun patent safra kanalları belirlenmesinde.
Patent kanalının ne olduğunu belirlemek için kanalın şeklinin ve lümeni çevreleyen hücrelerin analizini gerektirir. Her patent safra kanalını sayın ve görüntü numarasıyla aynı sütuna yerleştirin ve her portal damar görüntüsü için tekrarlayın. Son olarak, tüm portal damarların ve karaciğer örneğindeki tüm safra kanallarının toplamını hesaplayın ve karaciğer örneği için safra kanalını portal ven oranına hesaplayın.
P30 fare karaciğerleri, BD-PV oranını belirlemek için ck8 ve CK19 için vasküler marker alfa-SMA ile birlikte kesitli ve eş-lekeli olarak saptırıldı. Her karaciğer lobundaki tüm portal damarlar görüntülendiğinde, portal damarlar bitişik geniş spektrumlu sitokeratin boyama alfa-SMA lekeli damarlar olarak tanımlanmıştır. Geniş spektrumlu sitokatin içermeyen alfa-SMA leke yapıları analiz dışı edilen merkezi venlerdi.
Patent kanalları geniş spektrumlu sitokeratin-pozitif kolanjioktyes ile çevrili ve genellikle mezenkim ile yakındaki kanallar veya kolanjiyositayrılır açıkça tanımlanabilir lümen var. Tanımlanabilen lümeni olmayan geniş spektrumlu sitokatin pozitif hücreler, toplam safra kanalı sayısına dahil edilmez. Vahşi bir hayvandan karaciğer bölümü birkaç unincorporated hücreleri ile birlikte tam patent kanalı ile ilişkili bir portal ven gösterir.
Bir JAG1 heterozigot hayvan Temsilcisi karaciğer bölümü hiçbir patent safra kanalları üç portal damarları etrafında mevcut olduğunu gösterir. Buradaki tüm geniş spektrumlu sitokatin pozitif hücreler anonimdir ve bu nedenle, sayılmamalıdır. Üç yabani tip ve üç JAG1 heterozigot hayvan için BD-PV oranının analizi, iki genotipin safra yolu sayılarına göre nasıl kolayca ayırt edilebildiğini göstermektedir.
Safra yolları için tüm portal damarları değerlendirmek önemlidir. Karaciğer de henotypik değişkenlik varsa safra yolu yoğunluğunu belirlemek için özellikle önemlidir. Bu teknik Helgason bir fare modelinde biliyer fenotip bir genetik bastırıcı tanımlamak için kullanılmıştır.
Bu nedenle, safra hastalığı hayvan modellerinin tedavi yöntemlerinin değerlendirilmesinde yararlı olabilir.
