Safen ven, koroner arter bypass ameliyatı sonrası aniden arteriyel rahatsızlıklara maruz kalır. Mekanik strese adaptasyon tepkisini anlamak, ven grefti yetmezliğini önlemek için terapötik araçların tasarlanmasına yardımcı olabilir. Bu endotel hücre izolasyon protokolü çok basittir ve sadece kollajenaz ile inkübasyon gerektirir.
Minimal damar manipülasyonu ile bu, düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonun azalmasına neden olur. İnsan SVEC'lerinin izole edilmesi ve kayma stresi ve siklik gerilme altında kültürlenmesi protokolü, safen ven greft yetmezliği ile ilişkili endotel hücre disfonksiyonunda mekanik kuvvetlerin katkısını anlamak için gereklidir. Önceki endotel hücre kültürü, hücre ortamı takviyeleri açısından çok zordur.
Bir kültürü, insan SVEC'lerini başarılı bir şekilde izole etmek için büyüme faktörleri eklemek zorunludur. Primer insan safen ven endotel hücrelerini veya insan SVEC'lerini izole etmek için, en az iki ila üç santimetre uzunluğunda safen ven segmenti toplayın. Steril bir laminer akış başlığı altında çalışarak, damar segmentini önceden ısıtılmış PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.
Tüm kanı lümenin içinden çıkarmak için, bir pipete tutturulmuş ve PBS ile doldurulmuş bir pipet ucunu damarın bir ucuna yerleştirin ve yavaşça yıkayın. Yıkama akışı tamamen netleşene kadar yıkayın. Daha sonra damarın bir ucunu steril bir pamuk sütü ile kapatın.
Kabı mililitre kollajenaz tip 2 çözeltisi başına bir miligram ile dikkatlice doldurun ve kabın diğer ucunu bir pamuk sütü ile kapatın. Kabı kollajenaz çözeltisi ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ardından, diğer ucunu kesmeden önce kollajenaz çözeltisini toplamak için kabın bir ucunu 15 mililitrelik bir tüp üzerinde kesin.
Tüpün içindeki tüm ayrılmış endotel hücrelerini kollajenaz ile toplamak için luminal yüzeyi bir ila iki mililitre PBS ile yıkayın. Tüpü oda sıcaklığında 400G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini ek bir heparin çözeltisi içeren üç ila dört mililitre tam endotel hücre ortamında tekrar askıya alın.
Hücreleri, hacim başına %3 jelatin ağırlığı ile önceden kaplanmış 60 milimetrelik bir hücre kültürü kabında kaplayın. Hücreleri, ortamı değiştirmeden dört gün boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Bundan sonra, heparin takviyesi eklemeden ortamı her gün değiştirin.
Kırmızı kan hücrelerinin çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin. Ekstraksiyondan bir ila dört gün sonra, damar segmentinin boyutuna ve çapına bağlı olarak, insan SVEC'lerini faz kontrast mikroskobu ile görselleştirerek birleşme derecesini ve parke taşı morfolojisini değerlendirin. Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaşana kadar her iki günde bir ortamı değiştirmeye devam edin.
Akış odası sürgüsünü hacim başına %0,1 ağırlıkla kaplayın jelatin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. Akışkan üniteyi ve 10 milimetrelik rezervuarlara sahip steril perfüzyon setini dengelemek için, bunları bir gecede nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Kesme gerilme deneyi için, tohum 200.000 endotel hücresi, jelatin kaplı akış odası slaytına 100 mikrolitre kültür ortamında askıya alınmıştır.
Hücreleri kültür yüzeyine bağlamak için, hücreleri dört saat boyunca inkübe edin. Perfüzyon setini akışkan üniteye yerleştirin. Rezervuarları ve perfüzyon setini yaklaşık 12 mililitre önceden ısıtılmış tam endotel hücresi ortamı ile doldurun.
Her iki rezervuarın seviyesini beş mililitrede dengelemek için perfüzyon setinden hava kabarcıklarını çıkarın. Akışkan üniteyi, inkübatördeki oda sürgüsü olmadan monte edilmiş perfüzyon setine yerleştirin ve elektrik kablosunu bilgisayar tarafından düzenlenen pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında önceden tanımlanmış protokolü çalıştırarak, rezervuarlardaki ve perfüzyon setindeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
Akışkan üniteyi, laminer akış başlığına monte edilmiş perfüzyon seti ile alın ve bir birleşme hücresi tek katmanına sahip kızakları takın. Tüm üniteyi inkübatördeki slaytlarla yerleştirdikten sonra, elektrik kablosunu pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında, kızak tipini seçerek ve ortamın viskozitesini ayarlayarak akışkan ünitesi kurulumunu ayarlayın.
Akış parametrelerinde, kayma gerilimi değerini girin ve döngü süresini ve akış tipini ayarlayın. Ardından, denemeyi başlatmak için oynat düğmesini tıklayın. Slaytı, statik denetimler olarak akışa maruz kalmadan aynı ortamla muamele edilmiş hücrelerle tutmayı unutmayın.
25 milimetrelik 6 delikli eşeksenli yükleme istasyonunun üst kısımlarına ve yanlarına silikon bazlı yağlayıcı uygulayın. Tohum 400.000 hücre, kollajen ile kaplanmış 6 kuyucuklu esnek tabanlı kültür plakalarının her bir kuyucuğuna üç mililitre halinde askıya alınmıştır. Hücreleri% 100 akıcılığa ulaşana kadar nemlendirilmiş havada inkübe edin.
Germe protokolüne başlamadan önce, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın ve kuyucuk başına üç mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Taban plakasını inkübatördeki tüm yağlanmış yükleme istasyonlarıyla birlikte yerleştirin ve boruyu gerilim hücresi germe biyoreaktör sisteminin kontrolör ekipmanına uygun şekilde bağlayın. Her kültür plakasını biyoreaktör sistemi tarafından sağlanan bir kırmızı contaya takın.
Sonra onları inkübatördeki taban plakasına koyun. Uygun vakum ve germe yükü elde etmek için dört kültür plakasını da taban plakasına yerleştirin. Oyun kumandası ekipmanını ve bilgisayar sistemini açın.
FlexCell kontrol yazılımını açın ve uzama yüzdesi, dalga formu şekli, frekans ve zaman dahil olmak üzere istenen rejimi yapılandırın. Rejimi kurtarın. Vakum sistemini açın, ardından rejimi seçin ve germe işlemini çalıştırmak için bilgisayar ekranında başlat'ı tıklayın.
Silikon membranın hareket ettiğini ve hücreleri gerdiğini kontrol edin. Yapıştırılan endotel hücreleri, ekstraksiyondan 4 ila 10 gün sonra gözlemlenebilir. Başlangıçta tipik bir parke taşı morfolojisi gösteren hücre kümeleri oluştururlar.
EC belirteçleri CD31 ve VE-kadherini ifade ettiler. Kesme gerilmesi altında kültürlendiğinde hSVEC'ler akış yönünde hizalanır. 72 saat boyunca santimetrekare başına 20 dinin kayma gerilmesi, kesme uyaranının etkinliğini gösteren tipik mekanosensitif genlerin, KLF2, KLF4 ve NOS3'ün ekspresyonunu indükler.
Döngüsel gerilme sonucu, insan SVEC'lerine uygulanan yoğunluğa bağlıydı. Düşük gerilme altındaki hücreler, statik hücrelere benzer kortikal bir F-aktin paterni gösterdi. Nitrik oksit salınımında 72 saate kadar bir değişiklik olmadan, arteriyel gerilme seviyelerimiz 24 saat sonra aktin hücre iskeletini yeniden şekillendirdi ve 72 saat sonra NO salınımını azalttı.
Mekanik stres çalışmalarının yanı sıra, araştırmacılar izole edilmiş hücreleri endotel hücre fonksiyonu ve disfonksiyonu hakkındaki bilgileri genişletmek için çeşitli yöntemler uygulamak için kullanabilirler. Gösterilen protokolü takiben, kesme stresi ve gerilme altında başka herhangi bir endotel hücresi türünü incelemek mümkündür.
