S. Campione ve S. Haase, Ulusal Bilim Vakfı (DMS-1839288) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01GM126555) tarafından finanse edildi. Ek olarak, yazarlar makale hakkındaki yorumları ve protokolün beta testi için Huarui Zhou'ya (Duke Üniversitesi) teşekkür eder. Ayrıca Francis Motta (Florida Atlantik Üniversitesi) ve Joshua Robinson'a Java koduyla ilgili yardımları için teşekkür ederiz.

Deneyler arası karşılaştırmalar için eşitlenmiş zaman serisi verilerinin hizalanması

<ol>
	<li>Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cyclins:+Cln3+may+be+an+upstream+activator+of+Cln1,+Cln2+and+other+cyclins.">Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).</li><li>Schwob, E., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLB5+and+CLB6,+a+new+pair+of+B+cyclins+involved+in+DNA+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).</li><li>Polymenis, M., Schmidt, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cell+division+to+cell+growth+by+translational+control+of+the+G1+cyclin+CLN3+in+yeast.">Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast.</a> Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).</li><li>Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+cell+cycle-regulated+genes+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+microarray+hybridization.">Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).</li><li>Cho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transcriptional+analysis+of+the+mitotic+cell+cycle.">A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle.</a> Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).</li><li>Bar-Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+time+series+gene+expression+data.">Analyzing time series gene expression data.</a> Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).</li><li>Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Forkhead+transcription+factor+Hcm1+regulates+chromosome+segregation+genes+and+fills+the+S-phase+gap+in+the+transcriptional+circuitry+of+the+cell+cycle.">The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle.</a> Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).</li><li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+control+of+cell-cycle+transcription+by+coupled+CDK+and+network+oscillators.">Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators.</a> Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).</li><li>Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WHI1++gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+tethers+cell+division+to+cell+size+and+is+a+cyclin+homolog.">The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog.</a> EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).</li><li>Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+G1+and+G2+by+S-phase+cyclins+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).</li><li>Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generalized+model+for+multi-marker+analysis+of+cell+cycle+progression+in+synchrony+experiments.">A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments.</a> Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+inhibitor+Whi5+records+environmental+information+to+coordinate+growth+and+division+in+yeast.">Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast.</a> Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).</li><li>Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+molecular+noise+and+size+control+on+variability+in+the+budding+yeast+cell+cycle.">The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle.</a> Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).</li><li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+probabilistic+model+for+cell+cycle+distributions+in+synchrony+experiments.">A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments.</a> Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).</li><li>Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+branching+process+model+for+flow+cytometry+and+budding+index+measurements+in+cell+synchrony+experiments.">A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).</li><li>Duan, F., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+the+loss+of+cell-cycle+synchrony+in+clustering+analysis+of+microarray+data+using+weights.">Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights.</a> Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response:+analysis+by+flow+cytometry.">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li><li>Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+transcription+dynamics+during+the+budding+yeast+cell+cycle.">Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).</li><li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+and+arrest+of+the+budding+yeast+cell+cycle+using+chemical+and+genetic+methods.">Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).</li><li>Haase, S. B., Reed, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+flow+cytometric+analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle.">Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle.</a> Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).</li><li>Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+conservation+of+the+cell-cycle-regulated+transcriptional+program+in+the+fungal+pathogen,+Cryptococcus+neoformans.">Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).</li><li>Kelliher, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layers+of+regulation+of+cell-cycle+gene+expression+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).</li><li>Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JTK_CYCLE:+An+efficient+nonparametric+algorithm+for+detecting+rhythmic+components+in+genome-scale+data+sets.">JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets.</a> Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).</li><li>Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+large-scale+biological+rhythm+studies:+A+comparison+of+algorithms+for+detecting+periodic+signals+in+biological+data.">Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data.</a> Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).</li><li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsic+oscillator+drives+the+blood+stage+cycle+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Science. 368 (6492), 754-759 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu makale, senkronize hücre popülasyonları üzerindeki zaman serisi deneylerinden elde edilen verileri daha doğru ve nicel olarak değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, her deneyi14,15 parametrelendirmek için tomurcuklanan veriler ve akış-sitometrik DNA içerik verileri gibi giriş hücresi döngüsü faz verilerini kullanan bir Bayes çıkarım modeli olan CLOCCS'den öğrenilen parametreleri kullanır. CLOCCS, her bir deneyin parametrel...

Hücre döngüsü boyunca ilerlerken senkronize hücre popülasyonları üzerinde yapılan zaman serisi ölçümleri, hücre döngüsü ilerlemesini kontrol eden mekanizmaları araştırmak için standart bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8 . Senkron / serbest bırakma zaman serisi deneyleri arasında karşılaştırmalar yapabilme yeteneği, bu dinamik süreçleri anlamamız için hayati öneme sahiptir. Bulguları doğrulamak için yinelenen deneylerin kullanılması, sonuçların tekrarlanabilirliğine olan güveni artırabilir. Ayrıca, çevresel koşullar, mutantlar ve hatta türler arasındaki karşılaştırmalar, hücre döngüsü düzenlemesine ilişkin birçok yeni anlayışı ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, senkronizasyondan ve hücre döngüsü ilerlemesinin hızından kurtulmadaki deneyler arası değişkenlik, replikalar arasında veya değiştirilmiş hücre döngüsü zamanlamasına sahip deneyler arasında zaman noktasından zaman noktasına karşılaştırmalar yapma yeteneğini bozar. Bu zorluklar nedeniyle, replikalar genellikle tam zamanlı serilere dahil edilmez (örneğin, Spellman ve ark.4). Tüm zaman serileri için çoğaltmalar toplandığında, veriler toplu olarak analiz edilemez, bunun yerine analiz için tek bir çoğaltma kullanılır ve diğer çoğaltmalar genellikle ek rakamlara indirgenir (örneğin, Orlando ve ark.8). Ayrıca, farklı iyileşme veya hücre döngüsü ilerleme özelliklerine sahip deneyler arasında karşılaştırmalar yapmak zordur. İlgilenilen bir olay ile bir hücre döngüsü dönüm noktası (örneğin, tomurcuk ortaya çıkışı, S-fazı girişi veya anafaz başlangıcı) arasındaki daha küçük aralıkların ölçümleri, bu dönüm noktası olayları 1,2,3,9,10,11,12 izlenirse hataları azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, ince ama önemli farklılıklar bu geçici yöntemler kullanılarak tespit edilemeyebilir veya gizlenebilir. Son olarak, tek hücreli analizler, senkronizasyona veya hizalamaya13 güvenmeden hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmeye izin verir, ancak tek hücreli çalışmalarda büyük ölçekli ölçümler zor ve maliyetli olabilir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, senkronize popülasyonlarda yapılan zaman serisi ölçümlerinin analizine yardımcı olmak için Hücre Döngüsü Senkron Kaybının Karakterize Edilmesi (CLOCCS) modelini geliştirdik14,15. CLOCCS, senkronize hücrelerin hücre döngüsü aşamaları boyunca dağılımını, senkronizasyondan serbest bırakıldıkça ve hücre döngüsü boyunca ilerledikçe tanımlayan esnek bir matematiksel modeldir. Dallanma süreci çerçevesi, modelin, S. cerevisiae'de gözlemlendiği gibi, bölünmeden sonra anne ve kız hücrelerinin asimetrik niteliklerini hesaba katmasını sağlarken, S. pombe gibi fisyonla bölünen organizmalar için hala yararlıdır. Model, hücre döngüsü fazını belirtmek için çeşitli ölçüm türleri kümesinden girdiler alabilir. Zaman içinde tomurcuklanan hücrelerin yüzdesinin ölçümlerini içeren tomurcuklanan hücre döngüsü faz verilerini alabilir ve tomurcuklanmamış G1 fazı14,15'in dışındaki hücre sayısının tahmin edilmesine izin verir. Model ayrıca DNA içeriğini ölçen akış sitometrik verilerini de alabilir, böylece G1'den S'ye, S'den G2'ye ve M'den G115'e dönüm noktası geçişlerinin değerlendirilmesini sağlar. Floresan morfolojik belirteçler, hücre döngüsü fazını tanımlamak için de kullanılabilir. Miyozin halkalarının, çekirdeklerin ve iğ kutup gövdelerinin (SPB'ler) floresan etiketlemesi, hücre döngüsü fazını belirlemek için kullanılabilir ve bunlar CLOCCS model11'e dahil edilmiştir; ancak, bu ölçümler bu protokolde açıklanmayacaktır. Ek olarak, septasyon indeksi S. pombe14'ten gelen verileri modellemek için bir girdi olarak kullanılmıştır. Böylece, model çeşitli organizmalarda hücre döngüsü analizleri için kullanılabilir ve daha da genişletilebilir.
CLOCCS, giriş verilerinden çoklu parametrelerin (örneğin, tomurcuklanma yüzdesi, DNA içeriği) tam Bayes çıkarımına izin veren parametrik bir modeldir. Bu parametreler, senkronizasyondan kurtarma süresini, hücre döngüsü periyodunun uzunluğunu (anne ve yavru hücreler için ayrı ayrı tahmin edilir) ve hücrelerin her zaman noktasındaki ortalama hücre döngüsü konumunu içerir. Bu parametreler, popülasyondaki ortalama hücrenin davranışını temsil eder ve araştırmacının her zaman noktasını bir yaşam çizgisi noktası olarak ifade edilen bir hücre döngüsü konumuna haritalamasını sağlar. Yaşam çizgisi noktalarına dönüşüm, CLOCCS parametreleri lambda (λ) ve mu0 (μ0)14,15'e bağlıdır. λ parametresi, ana hücrelerin ortalama hücre döngüsü süresine karşılık gelir. Bununla birlikte, anne-kız gecikmesi14,15 nedeniyle, bu hem anne hem de kız hücrelerini içeren tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodu değildir. CLOCCS ayrıca anne-kız gecikmesine karşılık gelen delta (δ) parametresini çıkarır ve böylece tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodunun hesaplanmasına izin verir. Son olarak, her deneme hücre döngüsü eşitlemesinden serbest bırakıldıktan sonra başladığından, eşitleme yönteminden kurtarmak için gereken süre0 μ CLOCCS parametresiyle temsil edilir. CLOCCS, giriş hücresi döngüsü faz verilerine bir model sığdırır ve daha sonra rastgele bir yürüyüş Markov zinciri Monte Carlo algoritması14,15 kullanarak bu parametreleri çıkarır. Birden fazla deneyi ortak bir hücre döngüsü yaşam çizgisi zaman ölçeğine eşleyerek, iyileşme süresinin veya hücre döngüsü dönemlerinin aynı olmadığı çoğaltmalar veya deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalar yapılabilir 8,14,15.
Senkronize popülasyonlar14,15,16,17 zaman serisi boyunca bir oranda senkronizasyonu kaybettiğinden, senkronizasyon kaybı oranındaki değişkenlik deneyler arasında nicel karşılaştırmaları da engelleyebilir. Popülasyonların yerini ve dağılımlarındaki varyansı tanımlayarak, CLOCCS senkronize kayıp oranlarındaki farklılıkları açıklar. Bu güçlü araç, deneyler arasında spesifik ve ayrıntılı karşılaştırmalara izin verir, böylece sadece replikalar arasında değil, aynı zamanda çevresel koşullar, mutantlar ve hatta önemli ölçüde farklı hücre döngüsü zamanlamasına sahip türler arasında da doğrudan ilgili karşılaştırmalar yapma yeteneği sağlar14,15.
Bu makalede, senkronizasyon/sürüm zaman serisi deneylerinden gelen verileri sığdırarak parametreleri tahmin etmek, verileri ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine eşlemek ve ardından çoğaltmalar veya deneyler arasında ilgili karşılaştırmalar yapmak için CLOCCS'yi kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yaşam çizgisi hizalaması, bu deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalara izin verir, bu da kopyaların toplanmasına ve karşılaştırılmasına ve farklı kurtarma zamanlamaları ve hücre döngüsü dönemlerine sahip deneyler arasında daha alakalı karşılaştırmalar yapılmasına olanak tanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Fixative Solution. Described in Leman 2014.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% formaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Fixative Solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOCCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Git</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://git-scm.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java 19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For counting cells and buds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of synchronized time-series data using the characterizing loss of cell cycle synchrony model for cross-experiment comparisons

Hücre döngüsünün araştırılması, genellikle, hücreler hücre döngüsünü geçerken bir zaman serisindeki çeşitli parametreleri ölçmek için hücre popülasyonlarının senkronize edilmesine bağlıdır. Bununla birlikte, benzer koşullar altında bile, tekrarlanan deneyler, senkronizasyondan kurtulmak ve hücre döngüsünü geçmek için gereken sürede farklılıklar gösterir, böylece her zaman noktasında doğrudan karşılaştırmaları önler. Deneyler arasında dinamik ölçümleri karşılaştırma sorunu, mutant popülasyonlarda veya senkron iyileşme süresini ve / veya hücre döngüsü periyodunu etkileyen alternatif büyüme koşullarında daha da kötüleşmektedir. 
Daha önce, senkronize hücre popülasyonlarının senkronizasyondan nasıl salındığını ve hücre döngüsü boyunca nasıl ilerlediğini izleyen Hücre Döngüsü Senkron Kaybını Karakterize Etme (CLOCCS) adlı parametrik bir matematiksel model yayınladık. Modelden öğrenilen parametreler daha sonra deneysel zaman noktalarını senkronize zaman serisi deneylerinden normalleştirilmiş bir zaman ölçeğine (yaşam çizgisi noktaları) dönüştürmek için kullanılabilir. Yaşam çizgisi ölçeği, deneyin başlangıcından itibaren dakika cinsinden geçen süreyi temsil etmek yerine, senkronizasyondan hücre döngüsü girişine ve ardından hücre döngüsünün aşamalarına ilerlemeyi temsil eder. Yaşam çizgisi noktaları, senkronize edilmiş popülasyondaki ortalama hücrenin fazına karşılık geldiğinden, bu normalleştirilmiş zaman ölçeği, değişen periyotlara ve iyileşme sürelerine sahip olanlar da dahil olmak üzere deneyler arasında doğrudan karşılaştırmalara izin verir. Ayrıca, model, farklı türler (örneğin, Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe) arasındaki hücre döngüsü deneylerini hizalamak için kullanılmıştır, böylece evrimsel benzerlikleri ve farklılıkları ortaya çıkarabilecek hücre döngüsü ölçümlerinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlamıştır.

Time-series measurements made on synchronized populations of cells as they progress through the cell cycle is a standard method for investigating the mechanisms that control cell-cycle progression1,2,3,4,5,6,7,8. The ability to make comparisons across synchrony/release time-series experiments is vital to our understanding of these dynamic processes. The use of replicate experiments to corroborate findings can increase the confidence in the reproducibility of the conclusions. Furthermore, comparisons between environmental conditions, across mutants, and even between species can uncover many new insights into cell-cycle regulation. However, interexperimental variability in the recovery from synchrony and in the speed of cell-cycle progression impairs the ability to make time-point-to-time-point comparisons across replicates or between experiments with altered cell-cycle timing. Due to these challenges, replicates are often not included for the full time series (e.g., Spellman et al.4). When replicates for the entire time series are gathered, the data cannot be analyzed in aggregate, but rather a single replicate is used for analysis, and other replicates are often relegated to supplemental figures (e.g., Orlando et al.8). Furthermore, comparisons between experiments with different recovery or cell-cycle progression characteristics are difficult. The measurements of smaller intervals between an event of interest and a cell-cycle landmark (e.g., bud emergence, S-phase entry, or anaphase onset) can help reduce errors if these landmark events are tracked1,2,3,9,10,11,12. However, subtle but important differences may remain undetected or obscured using these ad hoc methods. Finally, single-cell analyses allow for analyzing cell-cycle progression without relying on synchronization or alignment13, though large-scale measurements in single-cell studies can be challenging and costly.
To overcome these difficulties, we developed the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) model to aid the analysis of time-series measurements made on synchronized populations14,15. CLOCCS is a flexible mathematical model that describes the distribution of synchronized cells across cell-cycle phases as they are released from synchrony and progress through the cell cycle. The branching process framework enables the model to account for the asymmetric qualities of mother and daughter cells after division, as observed in S. cerevisiae, while still being useful for organisms that divide by fission, such as S. pombe. The model can take inputs from a diverse set of measurement types to specify the cell-cycle phase. It can ingest budding cell-cycle phase data, which includes measurements of the percent budded cells over time, allowing for the estimation of the number of cells outside of the unbudded G1 phase14,15. The model can also ingest flow cytometric data that measures the DNA content, thus enabling the assessment of landmark transitions from G1 to S, S to G2, and M to G115. Fluorescent morphological markers can also be used to identify the cell-cycle phase. The fluorescent labeling of myosin rings, nuclei, and spindle pole bodies (SPBs) can be used to determine the cell-cycle phase, and these were incorporated into the CLOCCS model11; however, these measurements will not be described in this protocol. Additionally, the septation index was used as an input for modeling data from S. pombe14. Thus, the model can be used for cell-cycle analyses in a variety of organisms and can be further expanded.
CLOCCS is a parametric model that allows for the full Bayesian inference of multiple parameters from the input data (e.g., budding percentage, DNA content). These parameters include the recovery time from synchrony, the length of the cell-cycle period (estimated separately for mother and daughter cells), and the average cell-cycle position of the cells at each time point. These parameters represent the behavior of the average cell in the population, enabling the researcher to map each time point to a cell-cycle position expressed as a lifeline point. The conversion to lifeline points depends on the CLOCCS parameters lambda (&#955;) and mu0 (&#181;0)14,15. The parameter &#955; corresponds to the average cell-cycle period of the mother cells. However, due to the mother-daughter delay14,15, this is not the average cell-cycle period of the full population that includes both the mother and daughter cells. CLOCCS additionally infers the parameter delta (&#948;), which corresponds to the mother-daughter delay and, thus, allows for the calculation of the average cell-cycle period of the full population. Finally, because each experiment begins after release from cell-cycle synchronization, the time required to recover from the synchronization method is represented by the CLOCCS parameter &#181;0. CLOCCS fits a model to the input cell-cycle phase data and then infers these parameters using a random walk Markov chain Monte Carlo algorithm14,15. By mapping multiple experiments to a common cell-cycle lifeline time scale, direct phase-specific comparisons can be made between replicates or experiments where the recovery time or cell-cycle periods are not identical8,14,15.
As synchronized populations lose synchrony at some rate over the course of the time series14,15,16,17, variability in the rate of synchrony loss can also impede quantitative comparisons across experiments. By identifying the location of populations and the variance in their distributions, CLOCCS accounts for differences in rates of synchrony loss. This powerful tool allows for specific and detailed comparisons across experiments, thus providing the ability to directly make relevant comparisons not only between replicates but also between environmental conditions, mutants, and even species that have dramatically different cell-cycle timing14,15.
This paper describes a method using CLOCCS to estimate parameters by fitting data from synchrony/release time-series experiments, map the data to a common lifeline scale, and then make relevant comparisons between replicates or experiments. Lifeline alignment allows for direct phase-specific comparisons across these experiments, which allows for the aggregation and comparison of replicates and for making more relevant comparisons across experiments with different recovery timings and cell-cycle periods.

Yazar Spotlight: Deneyler Arası Karşılaştırmalar için Hücre Döngüsü Senkronizasyon Modelinin Karakterizasyon Kaybını Kullanarak Senkronize Zaman Serisi Verilerinin Hizalanması  

Çapraz deney karşılaştırmaları için hücre döngüsü senkron modelinin karakterizleştirici kaybı kullanılarak senkronize zaman serisi verilerinin hizalanması

Yukarıdaki protokolde ve Şekil 1'deki iş akışında açıklanan adımlar, iki temsili karşılaştırmayı göstermek için beş hücre döngüsü senkronize zaman serisi deneyine uygulanmıştır: farklı senkronizasyon yöntemlerine sahip replikalar (çiftleşme feromonu ve santrifüj elütriasyonu18) ve dizileme platformları (RNA-dizileme [RNA-seq] ve mikrodizi) arasında ve deneysel koşullar arasında. S. cerevisiae ile çoklu deneyler yapılmış v...

Watch this Scientific Journal Video about Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons at JoVE.com

Senkronize zaman serisi deneylerini analiz etmenin bir zorluğu, deneylerin genellikle senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan kurtarma uzunluğunda farklılık göstermesidir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler toplu olarak analiz edilemez veya kolayca karşılaştırılamaz. Burada, faza özgü karşılaştırmalara izin vermek için deneyleri hizalamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Investigating the cell cycle often depends on synchronizing cell populations to measure various parameters in a time series as the cells traverse the cell ...

Zaman serisi deneylerini analiz etmenin en büyük zorluğu, senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan iyileşme uzunluğunda genellikle farklılık göstermeleridir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler, hizalama olmadan toplu olarak kolayca karşılaştırılamaz veya analiz edilemez. Saatlerin yaşam çizgisi hizalaması, deneyler arasında faza özgü ve biyolojik olarak ilgili karşılaştırmalar yapmak ve her ikisi de daha önce zor veya imkansız olan çoklu çoğaltma deneylerini toplamak için kullanılan bir yöntemdir.Daha önce faza özgü ve biyolojik olarak ilgili karşılaştırmalar, dönüm noktası olaylarını izleyerek yapıldı. Bununla birlikte, bu geçici yöntemleri kullanarak, ince ama önemli farklılıklar tespit edilmeden kalır. Zaman serisi deneyleri arasındaki karşılaştırma, mutant popülasyonlarda veya senkronizasyon iyileşme süresini veya hücre döngüsü periyodunu etkileyen büyüme koşullarında olduğu gibi zamanlamada önemli farklılıklar gösteren deneyler arasında özellikle zordur.Saatlerin yaşam çizgisi hizalaması, bu durumlarda faza özgü karşılaştırmaya izin verir. Zaman serisi transkriptomik ve proteomik verileri hizalamak için saatler kullandık, bu da mRNA'nın dinamikleri ile karşılık gelen protein arasında doğrudan karşılaştırmaya izin verdi. Ayrıca, zaman serisi deneylerini farklı türler arasında hizalayarak hücre döngüsü evrimsel değişikliklerine kritik bilgiler sağlıyoruz.

alignment-synchronized-time-series-data-using-characterizing-loss

Research

JoVE Journal

Biology

Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons

860 Görüntüleme.  Duke University. Zaman serisi deneylerini analiz etmenin en büyük zorluğu, senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan iyileşme uzunluğunda genellikle farklılık göstermeleridir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler, hizalama olmadan toplu olarak kolayca karşılaştırılamaz veya analiz edilemez. Saatlerin yaşam çizgisi hizalaması, deneyler arasında faza özgü ve biyolojik olarak ilgili karşılaştırmalar yapmak ve her ikisi de daha önce zor veya imkansız olan çok...

Video: Yazar Spotlight: Deneyler Arası Karşılaştırmalar için Hücre Döngüsü Senkronizasyon Modelinin Karakterizasyon Kaybını Kullanarak Senkronize Zaman Serisi Verilerinin Hizalanması  

Investigating the cell cycle often depends on synchronizing cell populations to measure various parameters in a time series as the cells traverse the cell cycle. However, even under similar conditions, replicate experiments display differences in the time required to recover from synchrony and to traverse the cell cycle, thus preventing direct comparisons at each time point. The problem of comparing dynamic measurements across experiments is exacerbated in mutant populations or in alternative growth conditions that affect the synchrony recovery time and/or the cell-cycle period. 
We have previously published a parametric mathematical model named Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) that monitors how synchronous populations of cells release from synchrony and progress through the cell cycle. The learned parameters from the model can then be used to convert experimental time points from synchronized time-series experiments into a normalized time scale (lifeline points). Rather than representing the elapsed time in minutes from the start of the experiment, the lifeline scale represents the progression from synchrony to cell-cycle entry and then through the phases of the cell cycle. Since lifeline points correspond to the phase of the average cell within the synchronized population, this normalized time scale allows for direct comparisons between experiments, including those with varying periods and recovery times. Furthermore, the model has been used to align cell-cycle experiments between different species (e.g., Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe), thus enabling direct comparison of cell-cycle measurements, which may reveal evolutionary similarities and differences.

One challenge of analyzing synchronized time-series experiments is that the experiments often differ in the length of recovery from synchrony and the cell-cycle period. Thus, the measurements from different experiments cannot be analyzed in aggregate or readily compared. Here, we describe a method for aligning experiments to allow for phase-specific comparisons.