Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (Hibe 119/16) ve IMoh hibesi (3-15656) tarafından IKG'ye desteklenmiştir. R.S. Kreitman bursu tarafından desteklenmektedir.

Örnek olarak Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) şablonunu içeren .ast dosyası, Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır.
1. Medya hazırlığı
<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre Lactobacilli MRS suyunu (1 L deiyonize suda 55 g) ve %1.5 (a/h) agar içeren Lactobacilli MRS agar plakalarını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Otoklav sterilizasyonundan sonra, ortam doğrudan kullanıma hazırdır veya 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>% 50 (1 L deiyonize suda 15 g) Triptik soya suyu (TSB) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız), TSB %1 (a/h) D- (+) - glikoz ve% 1 (a / h) D- (+) - rafinoz ile desteklenmiş, ardından ortamı sterilize etmek için otoklavlayın. Kirlenmeyi önlemek için 4 °C'de saklanması tercih edilir.</li>
	<li>Glikozlu tamponlu bir ortam için,% 1 (a / h) D - (+) - glikoz, potasyum dibazik ile birlikte 5 mM potasyum fosfat monobazik ve 100 mM MOPS (3- (N-morfolino) propan sülfonik asit ile desteklenmiş TSB'yi hazırlayın, bkz. Daha sonra ortamı sterilize etmek için otoklavlayın.</li>
</ol>2. Numunelerin hazırlanması
NOT: Bu adım, diyetimizden fermente edilebilir veya fermente edilemeyen şekere yanıt olarak hücresel agregasyonun değerlendirilmesini içerir. Numune hazırlama işleminin şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmektedir.
<ol><li>Lactobacillaceae suşunu donmuş bir gliserol stoğundan (%50 gliserol) bir Lactobacilli MRS et suyu plakasına (%1.5 agar) koyun. NOT: Burada sunulan örnek deneyde, Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) ve Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG) probiyotik suşları kullanılmıştır. Bu metodolojiyi firmicutes filumunun ek probiyotik üyelerine genişletmek için Bacillus coagulans (ATCC 10545) seçildi.</li>
	<li>Hücreleri statik koşullar altında gece boyunca 37 ° C'de büyütün.</li>
	<li>5 mL Lactobacilli MRS suyunu tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca statik koşullar altında 37 °C'de büyütün.</li>
	<li>Önceki adımdaki hücre kültürünü (1:100) 3 mL %50 Triptik soya suyu (TSB), %1 (a/h) D- (+) - glikoz ile takviye edilmiş TSB veya %1 (a/h) D- (+) - rafinoz ile takviye edilmiş TSB içinde seyreltin.</li>
	<li>Statik koşullar altında gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri ortamda homojen bir şekilde karıştırarak numuneyi hazırlayın ve hücre kültürü tüpünü adım 2.5'ten itibaren nazikçe girdaplayın. Tam karıştırma gerçekleşene kadar test tüpünü yavaşça ters çevirin. 200-300 μL'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Agregaların kırılmasını önlemek için numuneyi sonikasyon yapmamak önemlidir. Adım 3.4'ten 3.10'a kadar olan veri toplama sırasında, numunelerin çok konsantre olduğu durumlar olabilir. Numunenin çok yavaş çalıştığı veya hiç çalışmadığı gözlemlenirse, numune uygun taze ortam ile seyreltilebilir.</li>
</ol>3. Veri toplama
<ol><li>Görüntüleme akış sitometresini üretici tarafından sağlanan talimatlara göre ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Karanlık alan ölçümü için 785 nm lazeri 5 mW'a ayarlayın (SSC olarak kısaltılan geleneksel akış sitometrisindeki yan saçılmaya eşdeğerdir). Sayısal diyafram açıklığı (N.A) 0,9 olan 60x lens kullanın, yüksek hassasiyeti seçin ve hızı düşük olarak ayarlayın.</li>
	<li>Herhangi bir veri toplamadan önce, SSC kanalındaki kalibrasyon boncukları akışının kararlılığından emin olun. "Fluidics" kutusundaki oynat düğmesine tıklayın ve boncuk görüntülerinin kalitesini inceleyin. Boncuk görüntüleri keskin ve net görünmelidir.</li>
	<li>Yükle düğmesine basın ve s'yi içeren bir tüp yerleştirin.ample (adım 2.6'dan itibaren) tutucuya.</li>
	<li>"Çalışma alanı" kutusunda yeni bir dağılım grafiği oluşturun. Yeni dağılım grafiği'ni tıklatın ve parlak alan kanalında SSC kanal yoğunluğuna karşılık gelen alanı seçin. Numune ile birlikte cihazda çalışan kalibrasyon boncuklarını hariç tutun. NOT: Boncuklar, yalnızca tamponlu bir numune yüklenerek ve boncukları Alan vs. SSC arsası. Ardından, Çokgen Bölgesi Oluştur düğmesini kullanarak boncuk popülasyonunun etrafına bir kapı çizin.</li>
	<li>"Edinme Ayarları" kutusuna örnek adını girin, veri depolamanın konumunu belirtin, kaydedilecek popülasyonu (boncuksuz tüm hücreler) seçin ve toplanacak olay sayısını ayarlayın. Tipik olarak, 10.000-20.000 olay yeterlidir.</li>
	<li>"Edinme" kutusunda bulunan Kaydet düğmesini tıklayın ve belirtilen olay sayısına ulaşıldığında edinme işlemi otomatik olarak sona erecektir.</li>
	<li>Tüpü boşaltmak için Geri Dön düğmesine tıklayın ve küçük bir pencerede istendiğinde tüpü tutucudan çıkarın.</li>
	<li>Her örnek için 3.5-3.9 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Sonraki tekrarlar için veri alımının tekdüzeliğini korumak için şablonu kaydedin.</li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Popülasyondan otomatik toplamanın yüzdesini (%) ölçün.<ol><li>IDEAS yazılımını kullanarak görüntüleme akış sitometresinde elde edilen verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Ham dosyadan (.rif) bir veri çözümleme dosyası (.daf) oluşturun ve bu dosya (.rif) dosyasını çözümleme yazılımına yükleyin. Dosya düğmesine tıklayın ve gerekli (.rif) dosyasını açın. Açılan pencerede, edinme analizini kullan'a tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.</li>
		<li>Odaklanılan olayları belirlemek için parlak alan kanalında bir gradyan RMS histogramı (görüntü kontrastı ve odak ölçümü) oluşturun. Analiz alanında, Yeni Histogram düğmesine tıklayın. "Yeni Histogram" penceresinde, analiz etmek için alımdan popülasyonu seçin ve "x ekseni özelliği"nde, parlak alan kanalının Gradyan RMS'sini seçin.<ol><li>Odaklanmamış olayları hariç tutmak için analiz alanındaki Çizgi Bölgesi Oluştur düğmesine tıklayarak bir geçit yerleştirin (Şekil 2A). NOT: Tipik olarak, "Odaklanmış" çizgi bölgesi, en yüksek Gradyan RMS puanına sahip olayların %80-%90'ını içermelidir, ancak her deney kurulumu için "odak" hücreleri için belirli eşikler belirlenmelidir.</li>
		</ol></li>
		<li>Parlak alan kanalının en boy oranıyla (genişlik bölü en uygun elipsin uzunluğu) karşılaştırılarak alanın (μm2) bir dağılım grafiği oluşturun. Analiz alanındaki Yeni Dağılım Grafiği düğmesine basın. "Yeni Dağılım Grafiği" penceresinde, 4.1.3 adımındaki Odaklanmış popülasyonu seçin.<ol><li>X ekseni unsuru için parlak alan kanalının Alanı'nı ve y ekseni unsuru için parlak alan kanalının En Boy Oranı'nı seçin. Bu dağılım grafiği, tekilleri ve küçük agrega olaylarını daha büyük mikrobiyal agregalardan ve zincirlerden ayırt etmek için odaklanmış popülasyon üzerinde geçit oluşturmaya izin verir.</li>
		</ol></li>
		<li>Bu dağılım grafiğinde, Dikdörtgen Bölge Oluştur düğmesini (veya Çokgen Bölgesi Oluştur) kullanarak, toplama olayları popülasyonu için alan değerine ve tekiller ve küçük agregalar popülasyonu için başka bir geçit çizin (Şekil 2B). NOT: Bazı arka planlarda, küçük agregaları tekillerden ayırmak zor olabilir, bu nedenle aynı kapıda birleştirilebilirler. Aynısı daha büyük agregalar ve zincirler için de geçerlidir (Şekil 3).</li>
		<li>Geçit stratejisinin güvenilirliğini doğrulamak için her kapıdaki olayların görüntülerini manuel olarak inceleyin ve değerlendirin. Gerekirse, kapının alan değerini ayarlayın. Bunu, "Popülasyonlar" açılır menüsünden incelenen popülasyonu seçerek gerçekleştirin. NOT: Geçit, analiz edilen bakterinin özelliklerine bağlı olarak değişebileceğinden, belirli bir alan değerine sahip değildir.</li>
		<li>Veri analizini şablon olarak kaydedin. Dosya sekmesine tıklayın, Template.ast Olarak Kaydet'i seçin ve veri çözümleme dosyasını (.daf) oluşturmak için aynı şablon altında sonraki örnek (.rif) dosyasını açın (LGG örneği olarak .ast dosyasını destekler).</li>
		<li>Daha fazla analiz için önemli olayları numaralandırmak üzere bir istatistik tablosu oluşturun. Raporlar sekmesine tıklayın, ardından İstatistik Raporunu Tanımla'ya tıklayın.</li>
		<li>Yeni pencerede, Sütun Ekle'ye tıklayın. Singlets/aggregates sayısını ve %gated istatistiklerini ekleyin. "İstatistikler" bölümünün altında %gated/count'ı seçin ve seçili popülasyonun altında singlets/aggregates'i seçin. İstatistiği listeye eklemek ve şablon olarak kaydetmek için İstatistik Ekle'yi tıklayın.</li>
		<li>İstatistik raporu oluştur'a tıklayın ve analiz için istatistik şablonunu ve (.daf) dosyalarını seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Agregaların boyut dağılımını ölçün.<ol><li>Toplama olaylarının ortalama boyutunu analiz etmek için, adım 4.1.5'teki toplama olayları popülasyonunun alanının (μm2) histogramını çizin (Şekil 2C).</li>
		<li>Veri analizini şablon olarak kaydedin. Dosya sekmesine tıklayın, Şablon Olarak Kaydet'i seçin ve veri çözümleme dosyası (.daf) için aynı şablon altında sonraki örnek (.rif) dosyasını açın.</li>
		<li>4.1.7-4.19 adımlarını tekrarlayın. Toplamaların boyutu için, istatistikler'in altında ortalama'yı seçin ve seçili popülasyonun altındaki toplamaları seçin. Özellikler altında, Parlak alan kanalının alanı'nı seçin. İstatistiği listeye eklemek ve şablon olarak kaydetmek için İstatistik Ekle'ye tıklayın.</li>
		<li>Bir istatistik raporu oluşturmak için adım 4.1.9'u tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak Mikrobiyal Otoagregasyonun Kantitatif Analizi

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells.">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars.">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).</li><li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

Akış sitometrisi, ökaryotik hücrelerde floresan yoğunluklarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak daha büyük boyutları veya küçük agregaları nedeniyle bakteri hücreleri için doğru ölçümler sağlayamayabilir. Bu faktörler, farklı koşullarda otoagregasyonun kesin miktar tayinini ve bazal agrega oluşumu seviyesini önemli ölçüde etkileyebilir. Bunu ele almak için, karbonhidratların probiyotik bakterilerin agregasyonunu nasıl etkilediğine dair daha iyi bir çözün?...

Bakteriyel otoagregasyon, biyofilm oluşumunda birincil adım olarak kabul edilir. Bu süreçte (bazen otoaglütinasyon veya flokülasyon olarak da adlandırılır), aynı tipteki bakteriler, sonunda kültür tüplerinin dibine yerleşen veya hedef dokularına veya yüzeylerineyapışan çok hücreli kümeler oluşturur 1.
Otoagregasyon yaygın olarak gözlenen bir fenomendir ve şimdiye kadar fırsatçı patojen Acinetobacter baumannii2, diş patojeni Aggregobacter actinomycetemcomitans3 ve ortaya çıkan patojen Burkholderia pseudomallei4 gibi Gram negatif patojenlerde gösterilmiştir. Otoagregasyon ayrıca birkaç probiyotik Gram-pozitif suşta 5,6,7,8 tanımlanmıştır. Lactobacillus (L.) acidophilus'ta, otoagregasyona kısmen S-tabakası proteinleri aracılık etti ve ksilan7'ye bir yapışma ile ilişkilendirildi. Benzer şekilde, glikoza bağlı otoagregasyon ile probiyotik türlerin yapışkan özelliklerinin indüksiyonu arasında bir korelasyon bulduk (müsine yapışma ile değerlendirildiği gibi) Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei ve Lactiplantibacillus plantarum5. Artan otoagregasyon, büyük olasılıkla, glikoz ve katabolitlerine yanıt olarak hücresel adezinlerin ekspresyonundaki değişiklikleri yansıtıyordu9. Otoagregasyonun moleküler mekanizmaları henüz belirlenmemiş olsa da, bu işlemin agrega edilmiş bakterilerin fenotipini değiştirdiği ve onlara çevresel stres faktörlerine 1 karşı gelişmiş toleransve ayrıca çekirdek algılama moleküllerine10 karşı artan hassasiyet sağladığı gösterilmiştir.
Otomatik toplamayı ölçmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır; Deneysel bir yaklaşım, kültürlerin belirli bir süre boyunca dar kültür tüplerinde statik olarak durmasına izin vermektir. Kontrol kültürleri bulanık kalırken, otoagregasyon kültürleri tüpün dibine yerleşecektir. Daha kantitatif bir yaklaşım, sedimantasyon veya çökeltme tahlili ile otoagregasyonu ölçer11.
Akış sitometrisi de son yıllarda bakteriyel otoagregasyonu araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yöntem, boyutu yaklaşık 0,5 ila 1000 μm arasındaki partikülleri analiz etmek için uygundur. Tek bakteri veya oluşan agregalar sıvı içinde süspanse edilir, bir akıntıya beslenir ve tek tek tespit edilebilir11. Öne doğru saçılan ışığın kaydedilmesi, hücrenin veya agreganın göreceli boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Nispeten hızlı ve basittir, ancak toplam boyutu veya agregalardaki ortalama hücre sayısı gibi çeşitli parametreleri algılayamaz. Bu nedenle, bu yaklaşım mikroskobik olarak tamamlanabilir ve daha fazla parametrenin kontrol edilmesine izin verir12. Bununla birlikte, geleneksel mikroskopi zaman alıcıdır ve bu nedenle test edilen numunelerin sayısını ve analizin istatistiksel gücünü sınırlar. Genel olarak, görüntüleme akış sitometrisi, hücre morfolojisi ve fenotipin eşzamanlı analizi, görüntü tabanlı analiz yapma, nadir olayları tespit etme ve akış sitometrisi verilerinin doğrulanması gibi geleneksel akış sitometrisine kıyasla çeşitli özellikler sağlar13. Bu avantajlar, akış sitometrisinin yeteneklerini geliştirir ve hücre popülasyonlarının daha ayrıntılı bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır.
Bu çalışma, laktik asit bakterilerinde (LAB) otoagregasyonu izlemek için görüntüleme akışı sitometrisi için değerli bir protokol sağlar. Bu Gram pozitif çubuklar fakültatif anaeroblardır ve LAB grubuna aittir. Bu verimli glikoz fermentörleri, karbonhidrat metabolizmasının ana son ürünü olarak laktik asit üretir14. Bu bakteriler mikrobiyomun faydalı çekirdek üyeleridir ve doğal olarak insanların ve hayvanların gastrointestinal sisteminde (GIT) ve ayrıca dişilerin ürogenital sisteminde bulunur15. Bu nedenle, otoagregasyon özelliklerinin kesin karakterizasyonu yüksek biyoteknolojik ve klinik ilgi çekicidir.
Önceki bulgularımız, bazal otoagregasyon seviyesinin farklı probiyotik suşlar arasında farklılık gösterdiğini göstermiştir. Bu heterojenlik, karbon kaynağı olarak kullanılan farklı karbonhidratlardan etkilenir5. Probiyotik bakterilerin bu temel özelliğinin üstesinden gelmek için, diyetteki karbonhidratların etkileri, IFC kullanılarak tek hücre düzeyinde otoagregasyon üzerinde izlendi. Bu IFC tabanlı yaklaşım, geleneksel akış sitometrelerinin gücünü ve hızını mikroskobun çözünürlüğü ile birleştirir. Bu nedenle, fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümlere izin verir16,17. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunu izlemek için floresan raportörlerle birleştirilen diğer probiyotik ve patojenik bakterilere ve heterojen agregalarda spesifik bakteri türlerinin varlığını ve bolluğunu izlemek için floresan etiketli suşlara genişletilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

Yararlı ve probiyotik bakteriler, konakçılarında önemli roller oynar ve bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklık da dahil olmak üzere çeşitli sağlık yararları sağlar. Lactobacillaceae ailesi, doğrulanmış probiyotik özelliklere sahip Gram pozitif bakterilerden oluşur. Bu çalışma, hücresel agregasyonun incelenmesinde tek hücreli yüksek verim analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillaceae türlerini bir model olarak kullanmaktadır. Odak noktası, bu faydalı türlerin diyetteki basit karbonhidratlara tepkisini analiz etmektir.
Çalışma, Görüntüleme Akış Sitometrisinin (IFC), karbonhidratların varlığında ve yokluğunda probiyotik bakterilerin montajındaki temel farklılıkların üstesinden nasıl gelebileceğini göstermektedir. IFC, konvansiyonel akış sitometrisinin gücünü ve hızını mikroskopinin uzamsal çözünürlüğü ile birleştirerek, faydalı bakteri suşları ve koşullarından oluşan bir kütüphane boyunca fenotipik olarak tanımlanmış bir şekilde yüksek hızlı karmaşık morfometrik ölçümler sağlar. Bu protokol, Lactobacillaceae türlerinin otoagregasyonu hakkında bilgi sağlar ve diyet karbonhidratlarına verdikleri tepkilere ışık tutarak, bu probiyotik bakterilerin yararlı etkilerinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunur.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

Yazar Spotlight: Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanarak Mikrobiyal Otoagregasyonda Araştırmaları Geliştirme

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

Sonuçlar, bu yöntemin LAB bakterilerindeki diyet şekerlerine yanıt olarak otoagregasyondaki farklılıkları kolayca ölçebildiğini göstermektedir. Yöntem, bireyleri agregalardan ayırarak, diyetten fermente edilebilir veya fermente edilemeyen şekerlere yanıt olarak tüm olaylardan agregasyon olaylarının popülasyonunun yüzdesinin hesaplanmasına izin verir. Ek olarak, tedaviler arasında toplam popülasyonun ortalama büyüklüğünde farklılıklar olup olmadığını ölçmek mümkün olmuştur.
<p cl...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Bu çalışmada, mikrobiyal otoagregasyonun incelenmesinde görüntüleme akış sitometrisi analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillus türleri bir model olarak kullanılmıştır. Odak noktası, Lactobacillus türlerinin diyetteki basit karbonhidratlara otoagregasyonunun tepkisini analiz etmektir. Otoagregasyonu ölçmek için en çok kullanılan yöntemler, mikrobiyal süspansiyonları, bulanıklığı veya optik yoğunluğu ölçen spektral fotometri ve parlak alan, faz kontrastı ve floresan mikroskobu gibi geleneksel mikroskopi teknikleridir.Yüksek verimli görüntüleme hakkında konuşurken, en büyük deneysel zorluklardan biri tek olay segmentasyonudur. Bu protokolde tek bir agregadır. Görüntüleme akışı sitometrisi bu zorluğu zarif bir şekilde ele alır ve araştırmacılara otoagregasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

498 Görüntüleme.  Ben-Gurion University of the Negev. Bu çalışmada, mikrobiyal otoagregasyonun incelenmesinde görüntüleme akış sitometrisi analizinin etkinliğini göstermek için Lactobacillus türleri bir model olarak kullanılmıştır. Odak noktası, Lactobacillus türlerinin diyetteki basit karbonhidratlara otoagregasyonunun tepkisini analiz etmektir. Otoagregasyonu ölçmek için en çok kullanılan yöntemler, mikrobiyal süspansiyonları, bulanıklığı veya optik yoğunluğu ölçen spektral fotometri ve parlak alan, faz kontra...

Video: Yazar Spotlight: Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanarak Mikrobiyal Otoagregasyonda Araştırmaları Geliştirme

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Biyoloji

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

Laktobacillaceae (Laktobacillaceae) Akış Sitometrik Analizi için Numune Hazırlama

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.