Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81960226,81760223) alınan hibelerle desteklenmiştir; Yunnan Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (202001AS070045,202301AY070001-011)

Deney protokolü, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Etiği ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (kmmu20220945). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 300-350 g Sprague-Dawley (SD) cinsi sıçanlar kullanıldı.
1. SAH modelini indükleme
<ol><li>Sıçanları% 2 izofluran ve% 100 oksijen kullanarak uyuşturun. İzofluran (%1-%3) ile sürekli inhalasyon anestezisi sağlayarak anesteziyi koruyun. Stereotaksik bir aparat kullanarak farenin kafasını sabitleyin (bkz.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek SAH modelini oluşturun.<ol><li>Suprasellar rezervuarın içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin. Daha sonra, sıçanın kuyruk arterinden (antikoagülan olmadan) bir şırınga pompası kullanarak suprasellar sarnıca otolog kan enjekte edin (bkz.</li>
		<li>Belirtilen koordinatları kullanarak sağ lateral serebral ventriküle bir mikroenjeksiyon iğnesi implante edin: bregma, −0.8 mm; yanal, 1,4 mm; derinlik, 4 mm9. SAK grupları için 0.2 mL sıçan kuyruğu arter kanı enjekte edin. Sahte gruplar için aynı hacimde izotonik salin uygulayın (Şekil 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Beyin dilimi hazırlama ve stabilizasyon
<ol><li>% 2 izofluran inhalasyonu kullanarak sıçanları derinlemesine uyuşturun. Dekapitasyondan sonra, tüm beyinleri çıkarın ve buz gibi yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF) daldırın. NOT: Aşağıdaki bileşime sahip taze hazırlanmış ACSF çözeltileri kullanın: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2 ve 10.11 mM D-Glikoz (Malzeme Tablosuna bakınız). pH'ı 7.3 ile 7.4 arasında tutun.</li>
	<li>%5CO2 ve %95O2 ile havalandırılan buz gibi ACSF'de SD sıçanlardan 200 μm kalınlığında akut beyin dilimleri hazırlamak için bir vibratom kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2).</li>
	<li>200 μm kalınlığındaki akut beyin dilimlerini ACSF'ye batırılmış naylon bir ağ üzerindeki bir saklama odasına yerleştirin. ACSF çözeltisini 35-37 °C sıcaklık aralığını koruyarak %95 O2 ve %5CO2 ile dengeleyin. Beyin dilimlerinin 2 saat boyunca stabilize olmasına izin verin ve uyum sağlamaları için zaman tanıyın (Şekil 3).</li>
</ol>3. Akut beyin dilimlerindeki perisitlerin TO-PRO-3 ile etiketlenmesi
NOT: Akut beyin dilimlerinden elde edilen perisitler, izleyici TO-PRO-310 kullanılarak floresan olarak etiketlendi.
<ol><li>Floresan boya TO-PRO-3'ü ACSF'ye ekleyin ve 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Akut beyin dilimlerini oda sıcaklığında TO-PRO-3 içeren ACSF ile karanlık bir ortamda 20 dakika inkübe edin. NOT: Koruma için TO-PRO-3'ü tutarken lateks eldiven giymeyi unutmayın.</li>
	<li>Beyin dilimlerini taşıyan naylon süzgeci yükleme odasından 6 oyuklu bir plaka durulama odasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Beyin dilimlerinin durulama odasında 10 dakika kalmasına izin verin (Şekil 4D). NOT: Bu durulama adımı, boyama işlemini sonlandırır, arka plan etiketlemesini azaltır ve spesifik olmayan lekelenmeyi önler.</li>
	<li>Preparatları% 5 CO 2 ve% 95 O2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu kullanarak toplam 15 dakika durulayın. Bu durulama adımı, boya alımını durdurur ve arka plan etiketlemesini en aza indirir (Şekil 4C).</li>
</ol>4. Akut beyin dilimlerinde serebral mikrosirkülasyonun hayati olmayan perisitlerinin boyanması
<ol><li>TO-PRO-3 ile önceden yüklenmiş beyin dilimlerini 37 ° C'de Alexa Fluor 488'e (FITC-ISOB4; 5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) konjuge edilmiş izolektin B4 ile karanlık bir ortamda 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beyin dilimlerini ACSF'de 15 dakika durulayın (Şekil 4E).</li>
	<li>Beyin dilimlerini her zamanki gibi %5 CO2 ve% 95 O2 ile gazlanmış ACSF'de inkübe edin. 37 °C'de her iki çözeltiye de 37 μM konsantrasyonda propidyum iyodür (PI) ekleyin. Bu, hayati olmayan beyin perisitlerini etiketleyecektir. Preparatları bu ACSF çözeltisinde karanlıkta 60 dakika inkübe edin (Şekil 4F).</li>
	<li>Ardından, boya alımını durdurmak ve arka plan etiketlemesini en aza indirmek için preparatları ACSF solüsyonlarıyla 15 dakika durulayın.</li>
</ol>5. Akut beyin dilimlerinde vital ve vital olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi
<ol><li>Plastik Pasteur pipetleri kullanarak beyin dilimlerini cam tabanlı konfokal kaplara (Malzeme Tablosuna bakın) nazikçe aktarın. Bulaşıkları daha önce% 5 CO2 ve% 95 O2 ile dengelenmiş ACSF çözeltisi ile doldurun. Sıçan beyin dilimlerini yerine sabitlemek için demir bir ağ kullanın.</li>
	<li>Cam tabanlı konfokal tabakları konfokal mikroskop aşamasına aktarın. Akut beyin dilimini çanağın dibine yerleştirin ve konfokal mikroskopi görüntüleme sırasında %95 O2 ve %5CO2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu ileperfüze edin 9 (Şekil 5A ve Şekil 5Ab').</li>
	<li>Serebral kortikal mikrovaskülatürün duvar hücrelerini 40x objektif kullanarak görselleştirin. Uyumlu yazılımı kullanarak görüntü yığınlarını yakalayın (bkz. IB4 (uyarma/emisyon 460 nm/520 nm), PI (uyarma/emisyon 545 nm/595 nm) ve TO-PRO-3 (uyarma/emisyon 606 nm/666 nm) için uygun filtreler kullanın (Şekil 5D). NOT: Aşağıdaki ayrıntılara sahip görüntüler yakalayın: 40× DIC N1 objektif lens, 3 × 12 bit: 512 × 512 piksel (0,22 × 0,22 mm), kalibrasyon: 0,42 μm/piksel.</li>
	<li>Serebral mikrovasküler sistemi ve perisitleri ağlarına ve morfolojilerine göre tanımlayın. Her beyin diliminde serebral mikrovasküler ağ içeren belirli bir bölgeyi bulun ve görüntü yakalayın.</li>
	<li>Sonraki çekimlerde tutarlılığı sağlamak için görüntüleme konumunu dikkatlice not edin (Şekil 5B,C). Daha fazla işleme ve analiz için görüntü analiz yazılımı (ImageJ) ve fotoğraf düzenleme yazılımı kullanın (bkz.</li>
</ol>

Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Perisit Kontraktilitesinin Görüntülenmesi

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Hayati beyin perisitlerini, hayati olmayan beyin perisitlerini ve beyin dilimlerindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Akut sıçan beyin dilimlerinde, işlem perisitlerin TO-PRO-311 ile ilk etiketlenmesini ve ardından IB412 ile mikrovasküler endotel hücrelerini gerektirir; daha sonra, ölen perisitlerin tanımlanması PI kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol basit, tekr...

İnce çıkıntıları ve çıkıntılı hücre gövdeleri ile ayırt edilen beyin perisitleri, mikrosirkülasyonuçevreler 1,2. Serebral kan akışı artışı ağırlıklı olarak kılcal damar genişlemesi tarafından yönlendirilirken, daha küçük arterler daha yavaş genişleme oranları sergiler3. Perisit kontraktilitesi, kapiller çap ve perisit morfolojisi üzerinde etki göstererek vasküler dinamiklerietkiler 4. Beyin perisitlerinin kasılması kılcal daralmaya yol açar ve patolojik senaryolarda aşırı kasılma eritrosit akışını engelleyebilir5. Locus coeruleus'tan salınan norepinefrin de dahil olmak üzere çeşitli faktörler, kılcal damarlarda beyin perisit kasılmasına neden olabilir6. Serebral kan akışında düzenleyici bir role sahip olan perisitler, hiperoksi7 sırasında bir oksijen sensörü görevi gören 20-HETE sentezi sergiler. Beyin perisitlerinin oksidatif-nitratif stresle tetiklenen kasılması kılcal damarları zararlı bir şekilde etkiler5. Beyin perisit kasılması ile ilgili hem in vivo hem de ex vivo araştırmalara rağmen8, beyin dilimleri içinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi ile ilgili sınırlı bilgi devam etmektedir.
En önemlisi, beyin perisitlerinin doku fiksasyonu sonrası görüntülemesi, canlılıklarını ve müteakip kasılma değerlendirmesini tehlikeye atar. Ayrıca, nörolojik bozukluklar gibi senaryolarda (ör., subaraknoid kanama - SAK), beyin perisitlerinin transgenik etiketlemesi, ön SAK kaynaklı beyin perisit ölümü çalışmamız9 tarafından onaylandığı gibi, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapamaz. 
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, canlı perisitleri etiketlemek için TO-PRO-3'ü kullandık, ölenler ise propidyum iyodür (PI) ile boyandı. Görüntüleme sırasında kesit aktivitesini korurken, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknolojileri kullandık. Bu makale, beyin perisitlerinin SAK sonrası serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkisini araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet ederek, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görüntülemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

Perisitler, serebral mikrosirkülasyon içinde yer alan ve kasılma ayarlamaları yoluyla serebral kan akışını aktif olarak modüle etmede çok önemli olan çok önemli duvar hücreleridir. Geleneksel olarak, kasılmaları, belirli koşullar altında morfolojik kaymalar ve yakındaki kılcal çap değişiklikleri gözlemlenerek ölçülür. Bununla birlikte, doku fiksasyonu sonrası, canlılığın değerlendirilmesi ve görüntülenen beyin perisitlerinin perisit kontraktilitesi tehlikeye girer. Benzer şekilde, genetik olarak etiketlenen beyin perisitleri, özellikle ön araştırmamızın beyin perisit ölümünü doğruladığı subaraknoid kanama (SAK) gibi nörolojik durumlarda, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapmada yetersiz kalmaktadır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir bir protokol geliştirilmiştir ve beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan beyin perisitlerinin aynı anda floresan etiketlenmesini sağlar. Bu etiketleme yöntemi, aynı anda beyin dilimi mikrovaskülatürünü işaretleyen yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop görselleştirmesine izin verir. Bu yenilikçi protokol, beyin perisit kontraktilitesini, kılcal damar çapı üzerindeki etkisini ve perisit yapısını değerlendirmek için bir araç sunar. Beyin perisit kontraktilitesinin SAK bağlamında araştırılması, serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkilerinin anlayışlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

Yazar Spotlight: Kemirgenlerde Subaraknoid Kanama Sonrası Perisitlerin Görüntülenmesi 

Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Dilimlerinde Vital ve Non-vital Beyin Perisitlerinin Görüntülenmesi

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

Normal fizyolojik koşullar altında, beyin perisitleri genellikle hücre ölümüne uğramazlar. Şekil 6 , hayati beyin perisitlerinin varlığını gösteren sarı ile bu fenomeni göstermektedir; beyin perisitleri, PI ile boyanma göstermez, bu da canlılıklarını gösterir. Hücre ölümünü takiben perisitlerin mikrovaskülatüre bağlı kalıp kalmadığını daha fazla araştırmak için, bir SAK sıçan modelinde yöntemler kullanıldı ve daha sonra görüntüleme yapıldı....

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pericytes Post-Subarachnoid Hemorrhaging in Rodents at JoVE.com

Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

Çalışmamız perisit ölümlerinde anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, SAK sonrası hasta bir attan başlayarak, düşük hayati parazitlerin sayısı ile SAK sonrası geçen süre arasında pozitif bir korelasyon olduğunu gösterdi. SAK ve parazit izolasyon tekniklerini takiben beyin kesitlerinde vital ve non-vital beyin parazitlerinin görüntülenmesi alanımdaki araştırmaları ilerletmiştir.Şu anda, ölü parazitler ve ölü endotel hücreleri arasında tam olarak ayrım yapmak oldukça zordur. Çalışmamızda SAK sonrası parazitlerde kasılmaya bağlı apoptoz saptanmıştır. Beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan bir beyin paraziti olan floresan etiketlemeyi sağlayan ve aynı zamanda çok güvenilir bir protokol geliştirdik.

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

703 Görüntüleme.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Çalışmamız perisit ölümlerinde anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, SAK sonrası hasta bir attan başlayarak, düşük hayati parazitlerin sayısı ile SAK sonrası geçen süre arasında pozitif bir korelasyon olduğunu gösterdi. SAK ve parazit izolasyon tekniklerini takiben beyin kesitlerinde vital ve non-vital beyin parazitlerinin görüntülenmesi alanımdaki araştırmaları ilerletmiştir.Şu anda, ölü parazitler ve ölü endotel hücreleri arasınd...

Video: Yazar Spotlight: Kemirgenlerde Subaraknoid Kanama Sonrası Perisitlerin Görüntülenmesi 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

Nörobilim

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

Murin Subaraknoid Kanama Modelinin İndüksiyonu ve Floresan Görüntüleme için Beyin Dilimi Hazırlanması

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

Floresan Görüntüleme için Sıçan Beyin Perisitlerinin Etiketlenmesi ve Boyanması

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.