A.A.J. ve M.A. makaleyi birlikte yazdılar ve tüm ortak yazarlar el yazması hakkında yorum yaptılar. M. A.A., CNRS ve "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322) tarafından desteklenmektedir.A.A.J., Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel ve Fondation du Collège de France tarafından desteklenmektedir.

Fare Oositlerinde Hücre İskeletinin Nükleer Şekil ve Kondensat Dinamiği Üzerine Etkisi

<ol>
	<li>Quinlan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Streaming+in+the+Drosophila+Oocyte.">Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte.</a> Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).</li><li>Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+perspective+on+cytoplasmic+streaming.">A physical perspective on cytoplasmic streaming.</a> Interface Focus. 5 (4), 20150030 (2015).</li><li>Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+positioning.">Nuclear positioning.</a> Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).</li><li>Metzger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+and+kinesin-dependent+nuclear+positioning+is+required+for+skeletal+muscle+function.">MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function.</a> Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).</li><li>Roman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+repair+after+physiological+damage+relies+on+nuclear+migration+for+cellular+reconstruction.">Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction.</a> Science. 374 (6565), 355-359 (2021).</li><li>Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nucleus+positioning+in+mouse+oocytes.">Control of nucleus positioning in mouse oocytes.</a> Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).</li><li>Brunet, S., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+vesicle+position+and+meiotic+maturation+in+mouse+oocyte.">Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte.</a> Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).</li><li>Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+markers+are+correlated+with+maturation-competence+of+human+oocytes.">Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes.</a> Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).</li><li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+diffusion+positions+the+nucleus+in+mouse+oocytes.">Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).</li><li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+fluctuations+of+the+nuclear+envelope+shape+the+transcriptional+dynamics+in+oocytes.">Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes.</a> Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).</li><li>Al Jord, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+forces+functionally+reorganize+nuclear+condensates+in+oocytes.">Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes.</a> Nat Commun. 13 (1), 5070 (2022).</li><li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), eaaf4382 (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mechanisms+of+gene+expression+control:+pre-mRNA+splicing+as+a+life+or+death+decision.">Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision.</a> Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).</li><li>Barutcu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+nuclear+domain-associated+transcripts+reveals+speckles+and+lamina+as+hubs+of+functionally+distinct+retained+introns.">Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns.</a> Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).</li><li>Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+stochastic,+motor-driven+properties+of+the+cytoplasm+using+force+spectrum+microscopy.">Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li><li>Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+and+chromatin+behavior+follow+MAP+kinase+activity+but+not+MPF+activity+during+meiosis+in+mouse+oocytes.">Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).</li><li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APCcdh1+activity+in+mouse+oocytes+prevents+entry+into+the+first+meiotic+division.">APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).</li><li>El-Hayek, S., Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+oocyte+growth+and+development+by+intercellular+communication+within+the+follicular+niche.">Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche.</a> Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).</li><li>Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centriole-+and+RanGTP-independent+spindle+assembly+pathway+in+meiosis+I+of+vertebrate+oocytes.">A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes.</a> J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).</li><li>Kal&#225;b, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+RanGTP-regulated+gradient+in+mitotic+somatic+cells.">Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells.</a> Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).</li><li>Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus+as+a+multiphase+liquid+condensate.">The nucleolus as a multiphase liquid condensate.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).</li><li>Terret, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOC1R:+a+MAP+kinase+substrate+that+control+microtubule+organization+of+metaphase+II+mouse+oocytes.">DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes.</a> Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).</li><li>Dumont, J., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+FRET+to+study+RanGTP+gradients+in+live+mouse+oocytes.">Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>. OOCytes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Carreau/OOCytes">https://github.com/Carreau/OOCytes</a> (2014)</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>. ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl">https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl</a> (2023)</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li><li>Yi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+maintenance+of+asymmetric+meiotic+spindle+position+through+Arp2/3-complex-driven+cytoplasmic+streaming+in+mouse+oocytes.">Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>. Stowers ImageJ Plugins Available from: <a target="_blank" href="https://research.stowers.org/imagejplugins/">https://research.stowers.org/imagejplugins/</a> (2023)</li><li>Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+interscale+wavelet+denoising+of+Poisson-corrupted+images.">Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images.</a> Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).</li><li>. Ovocyte_Nucleus Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus">https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus</a> (2023)</li><li>Letort, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , (2022).</li><li>. ImageJFiles Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak">https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak</a> (2023)</li><li>Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+shape+fluctuations+of+the+cell+nucleus.">On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).</li><li>Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+fluctuations+and+coalescence+of+nucleolar+droplets+in+the+human+cell+nucleus.">Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus.</a> Phys Rev Lett. 121 (14), 148101 (2018).</li><li>Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+nuclear+shape+fluctuations+associate+with+chromatin+condensation+in+early+prophase.">Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase.</a> Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).</li><li>Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+and+cancer.">Biomolecular condensates and cancer.</a> Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu protokoldeki temel adımlar, oositlerin hayatta kalmalarını veya normal işlevlerinietkilemeden uygun mikroenjeksiyonunu içerir 9,10,11 ve ayrıca nükleer benekler gibi ilgili yapıların doğru görselleştirilmesine izin verecek önceden tanımlanmış miktarlarda cRNA'nın mikroenjekte edilmesini içerir.
Sitoplazmik ve (intra)-nükleer dinamikler arasındaki bağlantıyı kurmak, hücre isk...

Nükleer konumlandırma, çoklu hücresel ve gelişimsel işlevler için gereklidir 1,2,3,4,5. Oosit adı verilen memeli dişi germ hücreleri, boyut olarak asimetrik bir bölünmeye uğramasına rağmen, çekirdeği hücre merkezinde konumlandırmak için sitoplazmalarını yeniden şekillendirir, bu da sonraki kromozomun merkezden uzaklaşmasınadayanır 6 (Şekil 1). Çekirdeğin bu merkezlenmesi, farelerde ve insanlarda başarılı oosit gelişimini 7,8 ve dolayısıyla embriyojenik potansiyellerini öngörür (Şekil 1).
Fare oositlerinde sitoplazmik yeniden şekillenme, esas olarak aktomiyosin hücre iskeleti9 tarafından yönlendirilir (Şekil 2). Aktivitesi, çekirdeği10 çalkalayan, yeniden konumlandıran ve nüfuz eden mekanik kuvvetler üretir (Şekil 2). Sonuç olarak, bu sitoplazmik-nükleoplazmik kuvvet iletimi, çekirdekte biyomoleküler kondensatlar 12,13,14,15,16 olarak bilinen birkaç zarsız organelden biri olan nükleer benekler11 olarak adlandırılan nükleer haberci RNA işleme organellerinin dinamiklerini ayarlar (Şekil 2).
Canlı görüntüleme, nükleer ajitasyonun işlevsel etkilerini deşifre etmede belirleyici olmuştur. Saatler boyunca nükleer göç filmlerinin yanı sıra aktin ağının ve toplu sitoplazmanın yüksek zamansal çözünürlüklü filmleri, farklı zaman ölçeklerini birbirine bağlayan nükleer konumlandırma için teorik bir modelin detaylandırılmasına büyük ölçüde katkıda bulundu9. Ayrıca, sitoplazmanın, nükleer anahatların ve kromatin ve nükleer kondensatlar gibi nükleer bileşenlerin yüksek zamansal çözünürlüklü filmleri, hücre içindeki farklı uzay-zamansal ölçekler arasında köprü kurarak, fare oositlerinde çekirdeğin hücre iskeleti tabanlı ajitasyonunun RNA işleme ve gen ekspresyonu üzerindeki rolünü vurguladı10,11. Toplamda, canlı görüntülemeye dayanan böyle bir ölçek geçiş yaklaşımı, çekirdeğin hücre iskeleti ajitasyonunu oositlerin gelişimsel başarısına bağlayan ilk mantığı sağladı.
Protokol, sitoplazmik kuvvetlerin (esas olarak F-aktin ve kısmen mikrotübüller tarafından üretilen) çekirdeğe ve fare oositlerindeki iç bileşenlerine iletimini incelemek için kullanılan görüntüleme ve görüntü analizi boru hattını sağlar. Bu deneylerin sonucu, sitoplazmik aktif hareketler, nükleer anahattın dalgalanmaları ve tek bir nükleer biyomoleküler kondensatların hareketi ve yüzey dalgalanmaları arasındaki bağlantıyı kuran iki yeni çalışmada10,11 gösterildiği gibi, sitoplazmadaki hücre iskeletinden nükleer iç kısma kadar uzamsal ölçeklerdeki kuvvetlerin sürekliliğini yakalamaktır: nükleer benekler. Aynı yaklaşım, sitoplazmik kuvvetlerin değişmesi beklenen diğer model sistemlere de uygulanabilir, örneğin malign kanser hücreleribağlamında 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 spinning disk</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMI6000B microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel</td>
			<td>Sutter Instruments Roper Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software&#160;</td>
			<td>Universal Imaging,&#160;</td>
			<td></td>
			<td>version 7.7.9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OF1 and C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retiga 3 CCD camera&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAeasy kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC35 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11826</td>
			<td>Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRSF2-GFP plasmid&#160;</td>
			<td>&#160;OriGene Technologies</td>
			<td>MG202528</td>
			<td>NM_011358</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripper Micropipette</td>
			<td>&#160;XLAB Solutions</td>
			<td></td>
			<td>specialized for oocyte collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 mMessage mMachine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1384&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 mMessage mMachine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM13344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic chamber</td>
			<td>Life Imaging Service</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows Excel</td>
			<td>Windows</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing cytoskeleton-based agitation of the mouse oocyte nucleus across spatial scales

Kadın infertilitesinin nedenlerini anlamada en büyük zorluk, oosit adı verilen dişi germ hücrelerinin gelişimini yöneten mekanizmaları aydınlatmaktır. Gelişimleri, embriyogenezi başlatmak için oositi sperm ile füzyona hazırlayan iki kritik aşama olan hücre büyümesi ve müteakip bölünmeler ile işaretlenir. Büyüme sırasında, oositler sitoplazmalarını çekirdeği hücre merkezinde konumlandırmak için yeniden düzenlerler, bu da farelerde ve insanlarda başarılı oosit gelişimini ve dolayısıyla embriyojenik potansiyellerini öngören bir olaydır. Fare oositlerinde, bu sitoplazmik yeniden düzenlemenin, aktivitesi çekirdeğe giren, yeniden konumlandıran ve nüfuz eden mekanik kuvvetler üreten hücre iskeleti tarafından yönlendirildiği gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu sitoplazmik-nükleoplazmik kuvvet iletimi, biyomoleküler kondensatlar olarak bilinen nükleer RNA işleme organellerinin dinamiklerini ayarlar. Bu protokol, fare oositlerinde uzamsal ölçekler boyunca hücre iskeletinin çekirdek üzerindeki etkisini yüksek zamansal çözünürlükle belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. i) oosit sitoplazmasındaki hücre iskeleti aktivitesini, ii) oosit çekirdeğinin hücre iskeleti bazlı ajitasyonunu ve iii) oosit nükleoplazmasındaki biyomoleküler kondensat dinamikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerekli görüntüleme ve görüntü analizi adımlarını ve araçlarını detaylandırır. Oosit biyolojisinin ötesinde, burada detaylandırılan yöntemler, ölçekler arasında nükleer dinamiklerin hücre iskeletine dayalı ayarını benzer şekilde ele almak için somatik hücrelerde kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Nuclear positioning is essential for multiple cellular and developmental functions1,2,3,4,5. Mammalian female germ cells named oocytes remodel their cytoplasm to position the nucleus at the cell center despite undergoing an asymmetric division in size, which relies on subsequent chromosome off-centering6 (Figure 1). This centering of the nucleus predicts successful oocyte development in mice and humans7, 8, and thus, their embryogenic potential (Figure 1).
Cytoplasmic remodeling in mouse oocytes is driven primarily by the actomyosin cytoskeleton9 (Figure 2). Its activity generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus10 (Figure 2). Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear messenger RNA-processing organelles named nuclear speckles11, one of several membrane-less organelles in the nucleus known as biomolecular condensates12,13,14,15,16 (Figure 2).
Live imaging has been decisive in deciphering the functional implications of nuclear agitation. Movies of nuclear migration over hours, as well as high-temporal resolution movies of the actin mesh and the bulk cytoplasm, largely contributed to the elaboration of a theoretical model for nuclear positioning, linking different timescales9. Also, high temporal resolution movies of the cytoplasm, nuclear outline and nuclear components such as chromatin and nuclear condensates, highlighted the role of cytoskeleton-based agitation of the nucleus on RNA-processing and gene expression in mouse oocytes, bridging different spatiotemporal scales within the cell10,11. Altogether, such a scale-crossing approach based on live imaging provided the first rationale linking cytoskeletal agitation of the nucleus to the developmental success of oocytes.
The protocol provides the imaging and image analysis pipeline used to study the transmission of cytoplasmic forces (generated primarily by F-actin and partly by microtubules) to the nucleus and its internal components in mouse oocytes. The outcome of these experiments is to capture the continuum of forces across spatial scales, from the cytoskeleton in the cytoplasm to the nuclear interior via high temporal resolution movies as shown in two recent studies10,11, that established the link between cytoplasmic active movements, fluctuations of the nuclear outline, as well as movement and surface fluctuations of a single type of nuclear biomolecular condensates: nuclear speckles. The same approach may be applied to other model systems where cytoplasmic forces are expected to change, such as in the context of malignant cancer cells17.

Yazar Spot Işığı: Fare Oositlerinde Mekano-Transdüksiyon ve Nükleer Ajitasyon Dinamiklerinin Aydınlatılması

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Şekil 3'teki görüntü panelleri, tipik bir tam büyümüş oosit örneklerini göstermektedir (Şekil 3A), tamamen büyümüş bir oositteki nükleoplazma YFP-Rango'yu ifade eder (Şekil 3B), tam büyümüş bir oositteki nükleoplazma doğru (sol panel; Şekil 3C) veya aşırı (sağ panel; Şekil 3C) SRSF2-GFP cRNA dozu ve SC35 antikoru kullanılarak tamamen büyümü?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Elucidating the Dynamics of Mechano-Transduction and Nuclear Agitation in Mouse Oocytes at JoVE.com

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

Laboratuvar, fare oositleri model sistemini kullanarak cinsel türlerin üremesi için gerekli olan dişi gam miktarının elde edilmesinde yer alan mekanizmaları daha iyi anlamayı amaçlamaktadır. Son zamanlarda, çekirdeğin ve içeriğinin ajitasyonunu teşvik eden ve fare oositlerinde maternal RNA'ların ince regülasyonuna yol açan yeni bir mekanik transdüksiyon süreci tanımladık. Bu protokolde sunulan görüntüleme ve görüntü analizi boru hattı, hücre iskeleti kuvvetlerinin sitoplazmadan çekirdeğe ve fare oositlerindeki nükleer RNA işleme gövdeleri dahil olmak üzere bileşenlerine ölçekler arasında bir süreklilik olarak iletimini vurgulamamızı sağlar.Bu protokol, ilk kez tek bir boru hattında birden fazla hücresel ölçekte ilk iletimi ele almamızı sağlayan basit araçlar sağlar. Biyofiziksel modelleme ile tamamlanan bu protokol, nükleer mekanikteki değişiklikleri ve enerjinin hücresel bölmeler arasında dağılımını ele almak için invaziv olmayan bir teknik oluşturur.

capturing-cytoskeleton-based-agitation-mouse-oocyte-nucleus-across

Research

JoVE Journal

Biology

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

525 Görüntüleme.  Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL. Laboratuvar, fare oositleri model sistemini kullanarak cinsel türlerin üremesi için gerekli olan dişi gam miktarının elde edilmesinde yer alan mekanizmaları daha iyi anlamayı amaçlamaktadır. Son zamanlarda, çekirdeğin ve içeriğinin ajitasyonunu teşvik eden ve fare oositlerinde maternal RNA'ların ince regülasyonuna yol açan yeni bir mekanik transdüksiyon süreci tanımladık. Bu protokolde sunulan görüntüleme ve görüntü analizi boru hattı, hücre iskeleti kuvvetlerini...

Video: Yazar Spot Işığı: Fare Oositlerinde Mekano-Transdüksiyon ve Nükleer Ajitasyon Dinamiklerinin Aydınlatılması

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.