Bu eser G.H. ve J.H. eğitim grant bursu üzerinden Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH) (CA009110) ve NIGMS (R01GM11755) P.W.J için tarafından desteklenmiştir

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Vahşi tipli C57BL/6J fareler üzerinde deneyler yapıldı.
1. hasat Fetal veya Neonatal yumurtalık ve profaz Kromatin hazırlanması yayılır
<ol><li>Post-coitum (dpc) embriyo 14,5-19,5 gün ayıklamak için servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre hamile kadın kurban. Not: Doğum sonrası gün 1 – 5 yumurtalık için 1.3 adıma atlayın. Şekil 1 farklı embriyonik ve doğum sonrası yaş zenginleştirilmiş segregasyonun profaz aşamalar özetler.</li>
	<li>V şeklinde bir açılış yapmak steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Anne rahim boynuz incelemek, embriyo Plasenta ayrı ve içine 35 mm petri yemekler Önceden ısıtılmış 1 fosfat tampon serum (PBS) 37 ° C'de x 3 mL içeren embriyo transferi Not: 37 ° C'de ayarla FLIPTOP İnkübatör ısısını korumak için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir sıcaklık düzenlenmiş cam sahne ısısını yumurtalık düzenleme sırasında korumak için de kullanılabilir.</li>
	<li>3,5 inç Cerrahi makas ile embriyo ya da yavru IACUC esaslarına göre işten çıkarma yoluyla kurban. Üç embriyo veya yavru daha fazla diseksiyon önce Önceden ısıtılmış PBS yerleştirin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış PBS 37 ° C'de 3 mL içeren ayrı 35 mm petri kabına döneminde bir embriyo veya yavru incelemek Embriyo, ön ayakları altında ve hind-bacaklarda ve şekil 2A-Bbelirtildiği gibi kuyruk üstünde doğrudan ön yarısı boyunca arka yarısının ventral orta çizgi boyunca keserek devam edin.</li>
	<li>3,5 inç Cerrahi makas kullanarak karın açın. İnce uçlu forseps kullanarak yerinden ya da çıkarmak belgili tanımlık karaciğer ve barsak, Önceden ısıtılmış PBS 37 ° C'de 3 mL içeren yeni 35 mm petri kabına yumurtalıklarda açığa döngüler ( şekil2B kılavuzuna bakın). Yumurtalık hemen altında ve böbrek Periton boşluğu (şekil 2B-C) arka duvarına doğru arkasında yer almaktadır. Erkek ve dişi gonads arasında differentiating için bir rehber şekil 2Bolarak sağlanır. Not: optimal koşullar için hamile kadın kurban sonra hızla yumurtalık incelemek.</li>
	<li>Her iki yumurtalık ince uçlu forseps bir diseksiyon kapsam ve seyretmek bardaklarda yer altında bir çift kullanarak her kadın fetus üzerinden kaldır yoksa ayrı Kuyu yapımı çok iyi Önceden ısıtılmış PBS içeren 0.5-1.0 mL plaka ve 37 ° C'de</li>
	<li>0.5 mL hipo-ekstraksiyon arabellek (17 mM TRISODYUM sitrat dihydrate, 50 mM Sükroz, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, proteaz inhibitörü, pH 8.2) bir temiz izle cam veya yumurtalıkların comp sokmak emin bir 9-şey plaka küçük bir kuyu yumurtalıklar her çifti yer letely. En az 15 dakika ama en fazla 30 dk kuluçkaya. Not: hipo-ekstraksiyon arabellek taze olun ve DTT ek içinde 2 h kullanın.</li>
	<li>Bir hidrofobik bariyer PAP kalemi kuluçka sırasında iki 22 x 22 mm2 kare şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi bir temiz cam 25 x 75 mm2, 1 mm kalınlığında mikroskop slayt çizin. Not: Slaytlar vaktinden önce hazır olun.</li>
	<li>100 mM Sükroz temiz bir slayt üzerine 45 – 50 µL pipette ve yumurtalık bir çift için açılan aktarın.</li>
	<li>İki 27 G iğneler keskin uçlarını kullanarak, yumurtalık ayrı hücreleri Sükroz çözüm içine serbest bırakmak için alay. Forseps ile büyük yumurtalık parçaları kaldırın ve dikkatli bir şekilde hücreleri dağıtmak için Sükroz çözüm pipet.</li>
	<li>Yer 40 µL sabitleştirici çözüm (%1 paraformaldehyde (PFA), % 0,2 deterjan (bakınız Tablo malzemeler), pH 9.2) her kareye bir hazırlanmış slayt içine. Bir 200 µl pipet ucuyla sabitleştirici çözüm eşit slayt yüzeye yayılmış.</li>
	<li>Her kareye bir sabitleştirici içeren slayt üzerine Sükroz karışımı 20 µL pipet. Not: Bu yumurtalık slayt başına bir çift kullanarak için eşittir.</li>
	<li>Gecede, oda sıcaklığında kapalı bir nemli odasında slaytlar kuluçkaya. Not: Gece kuluçka çevresinde değişebilir (12-15 saat) oda sıcaklığında.</li>
	<li>Odası kapağını açın ve slaytlar tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	<li>50 mL % 0,4 ıslatma ajanı PBS çözeltisi içeren bir Coplin kavanoz içindeki slaytları yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) 2 min için kurutma ve immunolabelling Protokolü (adım 6) devam edin. Not: Slaytlar-80 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak mümkün olabilir, ancak bu faiz protein bağlı olarak değişir. En iyi sonuçlar için derhal immunolabelling Protokolü (adım 6) gidin.</li>
</ol>2. metafaz Ben yumurta toplama
<ol><li>Her fare izole antral folikül sayısını en üst düzeye çıkarmak için intraperitoneally cinsel olgun bakire kadın fareler hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG, olarak da bilinen at koryonik gonadotropin (EKG)) ile 5 IU enjekte et. Not: hasat yumurta sayısı zamanla azalacak gibi için en uygun yumurta verimi, fareler 1-3 ay-in yaş, olmalıdır. PMSG hazırlamak için 5000 IU şişe 100 ml tek kullanımlık aliquots 600 µL-20 ° C'de, steril PBS (5 U/0.1 mL) deposunun dağıtılması</li>
	<li>44-48 h sonra koleksiyon orta, % 5 fetal sığır serum (FBS) ve 3 mg/mL sığır serum albumin (BSA; ile takıma en az gerekli orta alfa (MEMα) orta hazırlamak MEMα/BSA/FBS). Medya 0.2 µm gözenek filtre sterilize. MEMα/BSA/FBS orta fare başına bir cam çanak içine ve 37 ° c % 5 CO2 kuluçka sıcak 2.5 mL dikkatle boşaltmak. Not: Diğer topluluk ve ticari olarak kullanılabilir (M2 ve M16) kültür ortam da yaygın olarak kullanılır. Dikkat: İşleme adımları sırasında ortam havası pozlandırmayı en aza indirmek sınırlı bir süre için bir defada %5 CO2 kuluçka makinesi bir kültür yemekleri kaldırma öneririz.</li>
	<li>Servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre fareler kurban.</li>
	<li>Büyük bir V-şekilli açılış yapma steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Forseps kullanarak, bağırsak fare başkanı doğru yerinden. Rahim her boynuzun bulun; Yumurtalık proksimal göğüs kafesi için mevcut vardır. Ovidukt iyi Forseps ile tutun ve şişko çift diseksiyon makası (şekil 4) kullanarak yumurtalık kesti. Devam ovidukt tutun ve iyi forseps başka bir set ile bursa ve yer yumurtalıktan MEMα/BSA/FBS orta içeren koleksiyon çanak içine yayın. Not: adım 1 olduğu gibi bu yumurtalık 37 ° C'de tutmak ve % 5 CO2' de sürdürmek için zorunludur. %5 CO2 karıştırmak için bağladım FLIPTOP İnkübatör sıcaklık ve CO2 düzeyleri en iyi bakım için izin vermek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir sıcaklık düzenlenmiş cam sahne ısısını oosit düzenleme sırasında korumak için de kullanılmalıdır.</li>
	<li>1 mL şırınga ile bir 27'lik iğne (ya da benzer boyutta), kullanarak el ile büyük antral folikül delinme tarafından kümülüs oosit kompleksleri yayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskop kesilmediğini gözleyerek, ağız ile çalışan cam pipet veya kılcal veya elle işletilen mikrometre-enjektör (şekil 5) kullanarak GV sahnelenen yumurta toplamak. Yalnızca yayımlanan yumurta antral folikül toplamak. GV yumurta var bir çapı yaklaşık 90 µm. GV yumurta 2-3 kat granulosa hücreleri tarafından çevrili olması ve yaklaşık 200 µm toplam bir çapa sahip.</li>
	<li>Kültür yumurtalar temiz izle cam veya MEMα/BSA/FBS orta metafaz ulaşmak 6 h için içeren bir 9-şey plaka ben % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de.</li>
	<li>Adım 4'e geçin.</li>
</ol>3. metafaz II (MII) yumurta toplama
<ol><li>Her fare izole yumurtalar en üst düzeye çıkarmak için intraperitoneally cinsel olgun bakire kadın fareler PMSG ile 5 IU enjekte et. 44-48 h sonra intraperitoneally insan Korionik gonadotropin (hCG) ile 5 IU enjekte et. Not: hasat yumurta sayısı zamanla azalacak gibi için en uygun yumurta verimi, fareler 1-3 ay-in yaş, olmalıdır. HCG hazırlamak için bir şişe 10.000 U 200 ml PBS çözülür (5 U/0.1 mL). -20 ° C'de 600 µL tek kullanımlık aliquots saklayın</li>
	<li>12-14 saat'dan sonra MEMα/BSA/FBS koleksiyon orta, adım 2.2, yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>Servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre fareler kurban.</li>
	<li>Büyük bir V-şekilli açılış yapma steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Forseps kullanarak, bağırsak fare başkanı doğru yerinden. Rahim her boynuzun bulun, yumurtalık proksimal göğüs kafesi için mevcut. Ovidukt iyi Forseps ile tutun ve şişko çift diseksiyon makası (şekil 4) kullanarak yumurtalık kesti. Sonra yumurtalık ve ovidukt çıkarın ve MEMα/BSA/FBS orta içeren koleksiyon çanak içine yerleştirin. Not: olduğu gibi 1 ve 2 numaralı adımları, bu yumurtalık 37 ° C'de tutmak ve % 5 CO2' de sürdürmek için zorunludur. %5 CO2 karıştırmak için bağladım FLIPTOP İnkübatör sıcaklık ve CO2 düzeyleri en iyi bakım için izin vermek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir sıcaklık düzenlenmiş cam sahne ısısını oosit düzenleme sırasında korumak için de kullanılmalıdır.</li>
	<li>1 mL şırınga ile bir 27 G (veya benzer boyutu) kullanarak veya keskin forseps, MII yumurta serbest bırakmak için ovidukt ampulla bir delik gözyaşı. Not: ampulla yumurta zarar vermemeye dikkat et. Yumurta görülebilir (şekil 4) vardır öyle ki ampulla şişmiş ve yarı saydam görünür.</li>
	<li>Hasat MII yumurtalar bir ağız ile çalışan cam pipet veya kılcal veya elle işletilen mikrometre-enjektör (şekil 5) kullanarak toplama orta ile yeni bir çanak içine ovidukt ampulla üzerinden.</li>
	<li>Adım 4'e geçin.</li>
</ol>4. yumurta Denuding ve Zona pelusida kaldırma
<ol><li>300 IU/mL, 3 mg/kümülüs hücreleri (2.5 mL/fare) izle cam ve 37 ° c, % 5 CO2tutun çevreleyen yumurta denude için mL BSA ile takıma MEMα orta hyaluronidase hazırlayın. Not: Hyaluronidase etkinliği keskin hazırlık 1 h sonra azalır. MII yumurtalar için hyaluronidase tedavi gerekli değildir.</li>
	<li>Oosit-kümülüs hücre kompleksleri 300 IU/mL, MEMα/BSA 3 dk yumurta kümülüs hücreleri çevreleyen denude için hyaluronidase için maruz. Dikkat: yumurta zarar verir gibi hyaluronidase, maruz 3 dk fazla olamaz.</li>
	<li>Yumurta yıkama, yumurtalar için yeni bir transfer için MEMα/BSA orta çanağı ısıttı. Küçük ağız ile çalışan cam pipet veya kılcal (biraz daha büyük yaklaşık 90 µm olan yumurta, çapı daha) kullanarak, yukarı kompleksleri pipette ve tamamen kümülüs hücreleri ayırmak için aşağı. Yumurtalar için bir sonraki adım hazırlarken da kuluçka makinesine kurtarmak izin verir.</li>
	<li>Sıcak asit Tyrode'nın çözüm, MEMα/BSA ve Waymouth'ın medya 37 ° c (500 µL/fare). Yer 300 µL küçük 9-şey cam plakanın her şey içinde.</li>
	<li>Zona pelusida (ZP) kaldırmak için 5-10 yumurta Tyrode'nın çözüm aktarın. Yumurtalar için sadece 30-45 s çözüm için ortaya çıkarmak. Not: Çözüm için çok az pozlama ZP tamamen, hangi-ecek önlemek yumurta patlama ve yayılmasını kromozomlar kaldırmaz. Çok fazla maruz zarar ve oosit öldürmek. ZP erime diseksiyon mikroskop altında izlerken çekim hızı optimize yardımcı olabilir. Dikkat: işlevini yaşla azalır taze Tyrode'nın çözümünü kullanarak, önemlidir. Tyrode'nın çözüm taze bir kuyu ZP Tekdüzen sindirim sağlamak için tedavi yumurta her grup için kullanın.</li>
	<li>Hemen ZP kaldırıldıktan sonra yumurta ısıtılmış MEMα/BSA/FBS orta transfer ederek yıkayın. Bu yıkama işlemi tekrarlayın. Not: aktarırken, yumurta kolayca birlikte sopa olacak gibi ve cam pipet veya ZP kapiller aşağıdaki kaldırılması için dikkatli olun. Cam pipet veya kılcal Waymouth'ın orta ön ıslatma birbirine yapışmasını yumurtalar en aza indirmek olacaktır.</li>
	<li>Aktarım ve yumurta Waymouth'ın orta % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 30 dakika kurtarmak izin verir.</li>
	<li>Adım 5'e geçin.</li>
</ol>5. MI ve MII oosit Kromatin formaları
<ol><li>PAP kalem kullanma, şekil 6Aiçinde gösterildiği gibi cam slayt üzerinde 11 x 44 mm2 dikdörtgen çizin.</li>
	<li>Slayt sabitleştirici ince bir tabaka ile kat (% 1'paraformaldehyde, % 0,2 Triton-X 100 H2O, pH 9.2) 100 µL sabitleştirici bir slayda, pipetting ve slayt ileri geri sallanan tarafından. Slayt aşırı sabitleştirici kurtulmak için dokunun.</li>
	<li>5-10 yumurta iğneyle küçük ağzını pipet ile mümkün olduğunca küçük medya olarak arasında al ve iğne bir çizgide sabitleştirici kaplı slayt sabitleştirici çözüm içine slayt üzerinde 1 cm yumurta bozdurulması sürüklemek. Yumurtalar yatırılır ve patlama emin olmak için bir diseksiyon mikroskop kullanarak bu adımı gerçekleştirin. Not: Yumurtalar hemen slaytta patlaması. Yumurta olan yükseklik etkisi yayılan Kromatin derecesini yatırılır. Şekil 6 temsilcisi sonuçlarında daha ayrıntılı bilgi için bkz.</li>
	<li>Slaytlar Kromatin bağlı kalmak izin vermek için bir kapalı oksijen odasına gecede oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Tamamen kurumasına ve slaytlar % 0,4 ıslatma ajanı-H2O, pH 8.0 50 mL içeren bir Coplin kavanoza durulama slayt izin.</li>
	<li>Adım 6'ye gidin.</li>
</ol>6. Immunolabelling
<ol><li>Tablo 1' de açıklanan antikor seyreltme arabellek (ADB) hazırlayın.</li>
	<li>50 mL yıkama arabellek (WB) çözeltisi (ADB seyreltilmiş PBS içinde % 10) içeren iki Coplin kavanoz ve 50 mL WB ve % 0.05 deterjan solüsyonu içeren bir Coplin kavanoz hazırlamak (örneğin, 50 mL WB 250 µL % 10 deterjan ekleyin).</li>
	<li>WB 50 mL içeren bir Coplin kavanoza 1 ve 5 10 dk için bu protokol bölümünde hazırlanmıştır slaytları yıkayın. Dikkat: immunolabelling sırasında herhangi bir noktada kuru slayt izin vermeyin.</li>
	<li>10 dk Coplin kavanoz içeren 50 mL WB ve % 0.05 deterjan solüsyonu slaytlarını yıkayın. Sonra kalan Coplin kavanoza WB çözüm için 10 dk 50 mL içeren slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Seçili birincil antikorların ADB içinde seyreltilmiş 100 µL ile aşırı sıvı ve kapak slaydın dışına dokunun. Gecede odasında bir kapalı nemli 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Kuluçka 2 3 kısaltılmış gönderilen 37 ° C'de Antikor (örneğin, 50 µL) daha küçük hacimli bir coverslip veya parafilm içeren slaydı kapsayan tarafından kullanın.</li>
	<li>Slaytlar 50 mL % 0,2 ıslatma ajanı PBS çözeltisi, pH 8.0 içeren bir Coplin kavanoza durulayın.</li>
	<li>6.2-6,5 olan adımları yineleyin.</li>
	<li>Seçilen ikincil antikorların ADB içinde seyreltilmiş 100 µL ile aşırı sıvı ve kapak slaydın dışına dokunun. Slayt 1'e 2 kuluçkaya gönderilen bir kapalı nemli odasında 37 ° C'de.</li>
	<li>Slaytları 10 dk 50 mL % 0,2 ıslatma ajanı PBS çözeltisi, pH 8.0 içeren Coplin kavanoz için 2 kez yıkayın.</li>
	<li>Slaytları 2 kez 5 dakika % 0,2 ıslatma ajanı-H2O çözeltinin pH 8.0 50 mL içeren Coplin kavanoz içinde yıkayın.</li>
</ol>7. montaj slaytlar
<ol><li>2. adımda hazırlanan profaz Kromatin yayılır için montaj orta 4', 6-diamidino-2-phenylindole içeren 100 µL ekleyin (DAPI, 1.5µg / mL). İçin hazırlanan adım 5 MI ve MII Kromatin yayılır, DAPI içeren montaj orta 50 µL Ekle (1.5µg / mL). Yavaşça uzak aşırı sıvı leke.</li>
	<li>22 mm x 60 mm coverslip üstüne koyun ve açık oje ile mühür. 4 ° C veya -20 ° C de bir slayt kutu değerlendirme Floresans mikroskobu ile kadar saklayın. Not: aşırı montaj orta oje ile sızdırmazlık önce kurtulmak dokunun hafifçe kapak notu.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Keeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spo11+and+the+Formation+of+DNA+Double-Strand+Breaks+in+Meiosis.">Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis.</a> Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+Pairing,+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis.">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).</li><li>Vries, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Sycp1+functions+in+synaptonemal+complex+assembly,+meiotic+recombination,+and+XY+body+formation.">Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation.</a> Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+Mlh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).</li><li>Lipkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+arrest+and+aneuploidy+in+MLH3-deficient+mice.">Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice.</a> Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).</li><li>Kolas, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+MMR+proteins+on+meiotic+chromosomes+in+mice+indicates+distinct+functions+during+prophase+I.">Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I.</a> J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Cohesin+and+Condensin+in+Chromosome+Dynamics+During+Mammalian+Meiosis.">Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis.</a> J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).</li><li>Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+complex+chromosome+structures+during+meiosis:+versatile+deployment+of+Smc5/6.">Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6.</a> Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).</li><li>Hopkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+cohesin+component,+Stag3+is+essential+for+maintaining+centromere+chromatid+cohesion,+and+required+for+DNA+repair+and+synapsis+between+homologous+chromosomes.">Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes.</a> PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMC5/6+is+required+for+the+formation+of+segregation-competent+bivalent+chromosomes+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes.</a> Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).</li><li>Kota, S. K., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+transitions+in+germ+cell+development+and+meiosis.">Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis.</a> Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).</li><li>Taketo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspread+ovarian+cell+preparations+for+the+analysis+of+meiotic+prophase+progression+in+oocytes+with+improved+recovery+by+cytospin+centrifugation.">Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation.</a> Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).</li><li>Sun, X., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+recombination+in+mouse+oocytes.">Studying recombination in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).</li><li>Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+meiosis-specific+cohesins+in+mouse+embryonic+oocytes.">Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).</li><li>Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mammalian+female+meiosis.">Analyzing mammalian female meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+human+aneuploidy:+where+we+have+been,+where+we+are+going.">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).</li><li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+In+vivo+and+In+vitro:+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs.">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li><li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes.">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kromatin yayılmış hazırlıklar araştırmacılar dişi memeli mayoz ve proteinlerin dahil dinamik yerelleştirme kronolojik olarak çalışmaya izin verir. Embriyonik ve neonatal Kromatin yayılır segregasyonun profaz boyunca olayların yakın analiz için izin verir. Metafaz ben ve metafaz II Kromatin yayılır tek kız kardeşi fark için kullanılan chromatids gelen kız ve eşlenmiş homolog kromozomlar, Ploitlik değerlendirmek yanı sıra eşleştirilmiş. Buna karşılık, burada açıklanan Protokolü sık s...

Sperma sırasında büyük yarı zaman uyumlu dalgalar segregasyonun germ hücrelerinin hızla ve sürekli olarak ergenlik ve yetişkinlik1boyunca başlangıçlı, testis içinde doldurulan vardır. Erkeklerin aksine, mayoz dişilerde fetal gelişim sırasında yalnızca başlatılır. Doğum yumurtalar profaz uzun süreli dictyate aşamasında tutuklanan kalır ben bir bozulmamış germinal vezikül (GV; nükleer zarf) ergenlik kadar ile. Ergenlik başlangıcında, yumurta kümesini cyclically seçilir büyüme ve olgunlaşma, segregasyonun yeniden başlamasını inisiyasyon işaretleme geçmesi. Köklerin yumurta içinde segregasyonun yeniden başlamasını GV germinal vezikül arıza (GVBD) bilinen bir işlemle ortadan kalkması ile kendini gösteriyor. Yumurta sonra kromozom yoğunlaşma ve segregasyon, kutup vücut ekstrüzyon tarafından takip uğrar. Yumurtalar MII ilerleme üzerine tutuklandı olmak ve döllenme sonra ikinci ve son segregasyonun bölümü tamamlamak için uyarılmış.
Kadın doğurganlık segregasyonun profaz başarısı üzerine son derece bağımlı ben ilerleme. Bu indüklenen DNA Çift Kişilik kırılmalara (DSBs) crossover rekombinasyon2bağlantısı tamiri tarafından aracılık ettiği chiasmata olarak bilinen homolog kromozomlar arasında fiziksel bir bağlantı oluşumunu anahtarıdır. Homolog kromozomlar arasında onların synapsis3kolaylaştırmak için formlar synaptonemal kompleksi (SC) olarak bilinen dinamik bir protein açısından zengin iskele bağlamında bu işlem gerçekleşir. SC homologs birlikte boyunca devam eden DNA tamiri tutan Merkez Bölge proteinler tarafından bağlı iki paralel yanal öğelerden oluşur bir fermuar gibi üçlü yapısıdır. Synapsis önce Aksiyel öğeler, adı yanal elemanlarının öncüleri arasında kardeş chromatids oluştururlar. Synaptonemal kompleks proteinlerin SYCP2 ve SYCP3 gibi kardeş Kromatit uyum eksenleri sırasında erken profaz colocalize eksenel öğeleri oluşturur. Daha sonra siteleri enine filaman protein, Merkezi öğesi derleme ve synapsis hizalanmış homologs4arasında kolaylaştırır SYCP1 için bağlayıcı olarak hizmet vermektedir. Fare yumurtalar tam synapsis 20 varlığı ile tamamen SYCP3 ve SYCP1 uzanıyor, Kromatin kullanarak görüntülenir üst üste hazırlıklar yaymak belirtilir. Synapsis sayede formu chiasmata homologs arasında mukadder olan olgun kesişim onların doğru işleme5,6 tanıtmak için mutL homolog (MLH1/3) dimer ile dekore edilmiş olup pachytene substage girdiği üzerine tamamlandı , 7. kromozom (SMC) kompleksleri, cohesin, condensin ve SMC5/6 karmaşık, dahil olmak üzere yapısal bakımından önemli kromozom dinamikleri ve yapısı mayoz8,9, boyunca düzenlenmesi için 10,11,12. Toplu olarak, bu olaylar uygun BI-yönünü homolog kromozomlar iğ Polonyalılar SC sökme takip karşıt sağlamak
Segregasyonun hücre döngüsü genom bakım programlanmış indüksiyon ve DNA DSBs sonraki onarım nedeniyle çeşitli proteinlerin rolleri incelemek için güçlü bir modeldir. Ayrıca, memeli mayoz Ayrıca, epigenetik değişiklikler ve basma13ilgili bir modelidir. Ancak, memeliler (şekil 1) fetal ve neonatal yumurtalıklarda yer alan kadın mayoz sırasında bu olayları değerlendirmek teknik olarak zordur. 5 substages ayrılabilir profaz: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ve dictyate. Burada, biz ayırmak ve fetal ve neonatal yumurtalıklar ve testis (Şekil 2) arasındaki farkı anlatan. Önceden açıklanan yöntemleri uyarlanmış, bu el yazması da bir iletişim kuralı (Adım 1) kadın segregasyonun profaz hazırlanması için video gösterisi ile özetliyor ben Kromatin yayılır14,15,16,17 . 6-7, adımlarda açıklandığı gibi immunolabelling ile birleştiğinde bu protokolü profaz detaylı mikroskopik analiz sağlar ben yumurta olaylarda.
Oogenesis hata eğilimli olduğunu ve kromozom missegregation olaylar ilk segregasyonun bölünme sırasında döl18,19genetik hastalığın en yaygın kaynağı temsil eder. Bu makale (iletişim kuralı adım 2), biz olgun yumurta GV sahnelenen yetişkin dişi fareler astarlanmalıdır yumurtalıklar ayıkladığınız bir protokol tanımlamak. Destekleyici koşullar altında köklerin yumurta yalıtım ve kültür20takip mayoz Lüteinizan bağımsız yeniden başlamasını tabi. Segregasyonun yeniden başlamasını takiben yumurta mayoz ilerleme sonra metafaz II tutuklayın. Yumurta döllenmiş sürece. metafaz II, tutuklandı kalır Adımları 2-5, biz daha önce raporlanmış iletişim kuralları toplamak, kültür ve yaymak Kromatin hazırlıklar21için MI ve MII yumurta hazırlamak nasıl açıklamak için video gösterisi ile uyum. Teknik yayılan bu Kromatin kromozom ile ilişkili proteinlerin açık immunolabelling sağlar. Ayrıca, bu iletişim kuralını bivalent ve univalent kromozomlar arasında ayırt etmek için de kullanılabilir ve daha fazla tek kız kardeşi çözümlemek için yumurta Ploitlik değerlendirilmesi kolaylaştırmak için chromatids. Bu nedenle, yerelleştirme desenleri segregasyonun proteinlerin açığa yanı sıra, bu iletişim kuralını da kromozom missegregation MI ve MII sırasında olası nedenleri elucidating paha biçilmez bir araç olarak hizmet edebilir.

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mm petri dishes</td><td>Denville</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection scissors</td><td>Ted Pella</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting&amp;nbsp;scissors, sharp tip, 41/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Watch glass square 1 5/8</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>742300</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium Citrate Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>50x Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td></tr><tr><td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td><td>Becton, Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td><td>Thermo</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent in manuscript</td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>74257</td><td>Wetting agent in manuscript</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td><td>Sigma</td><td>C0434</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>Autoclave before each use</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher</td><td>22260943</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Brand Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>BR701501</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5B</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td><td>Fisher</td><td>14-178-5D</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Mitutoyo micrometer head</td><td>Mituoyo</td><td>150-208</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.45 &amp;mu;m filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&quot;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm pipette tip</td><td>Denville</td><td>P3080</td><td>For making oocyte collection needles</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth&#039;s media</td><td>Life Technologies</td><td>11220035</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Fisher</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>For oocyte culture media</td></tr><tr><td>500ml filter units 0.22um</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s solution</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td>Store aliquots at -20C</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td>For ADB/wash buffer</td></tr><tr><td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP1</td><td>Life Technologies</td><td>PA1-16763</td><td>Dilution factor- 1:1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>Dilution factor- 1:50</td></tr><tr><td>Human anti-centromere protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti- TOPOII</td><td>Abcam</td><td>ab109524</td><td>Dilution factor- 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>Dilution factor- 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11057</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-31573</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11013</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Dilution factor- 1:500</td></tr></tbody></table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Kromatin yayılmış teknikleri yaygın olarak gametogenesis, sperma için özellikle sırasında çeşitli proteinlerin yerelleştirme dinamik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu teknikler izin homolog kromozom çifti, gibi segregasyonun olaylar sırasında protein ve DNA yerelleştirme desen canlandırma için synapsis ve DNA tamir. Birkaç protokolleri literatürde tarif var, genel Kromatin yayılmış teknikleri memeli profaz yumurta kullanarak sınırlı ve fetal yumurtalık mayoz inisiyasyon zamanlama nedeniyle zor vardır. Buna karşılık, profaz spermatocytes mikrodiseksiyon gerek kalmadan daha yüksek verimleri ile genç erkek fareler gelen toplanabilir. Ancak, hücre saf bir eşitlenmiş nüfusu nedeniyle çocuk ve yetişkin testis segregasyonun ve sonrası segregasyonun germ hücre popülasyonlarının heterojen belirli aşamalarında elde etmek zordur. Mayoz sonraki aşamalarını için yumurta geçiren mayoz ben (MI) veya mayoz II (MII), çünkü yetişkin dişi fareler toplanan ve mayoz kültür devam etmek için teşvik olgun yumurta grupları değerlendirmek için avantajlıdır. Burada, yumurta kullanarak segregasyonun Kromatin yaymak hazırlıkları için yöntemler üzerinden fetal, Yenidoğan disseke ve yetişkin yumurtalık video gösteriler eşlik ile açıklanmıştır. Kromozom missegregation memeli yumurta olaylarda özellikle MI sırasında sıktır. Bu teknikler değerlendirmek ve etkileri farklı mutasyon veya çevre Etkilenmeler oogenesis çeşitli aşamalarında tanımlamak için kullanılabilir. Oogenesis ve sperma arasında belirgin farklılıklar olduğundan, içinde açıklanan teknikleri memeli oogenesis anlayışımızı ve kromozom ve protein dinamiği cinsel dimorfik özellikleri mayoz sırasında artırmak için çok değerli .

Görselleştirme ve yumurta segregasyonun kromozomlar değerlendirilmesi için iki teknik anlatmıştık. İlk teknik profaz ilerlemesinde embriyonik ve neonatal yumurtalıkların değerlendirilmesi doğru yiyecek ve içecek. Profaz Kromatin yayılmış ürünleri çok sayıda dinamik süreçler kromozom çifti, synapsis dahil olmak üzere, mayoz sırasında görüntülenmesi için son derece değerli ve desynapsis, homolog rekombinasyon ve epigenetik kromozom remodeling. Burada, bu yönt...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Fare Oositinin Profazdan Metafaz II'ye İlerlemesinin Analizi için Kromatin Yayılımı Hazırlıkları | Genetik | Video

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

chromatin-spread-preparations-for-analysis-mouse-oocyte-progression

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Genetics

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

15.3K Görüntüleme.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Video: Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Gelişim Biyolojisi

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

At Oositlerinde Kromozom Ayrımı, Histon Asetilasyonu ve İşmili Morfolojisi Analizi

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biyoloji

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...