Bu çalışma, Richard M. Schultz &#39;un laboratuvarında gerçekleştirildi. Yazarlar ayrıca sentromer sayma tahlil ve onun konfokal mikroskop erişim kavramsallaştırma Michael Lampson kabul etmek istiyorum. Teresa Çan ve Francesca Duncan sentromer sayma tahlil optimize etmede yardımcı oldu. Paula Stein HD022681 tarafından desteklenen (RMS) ve Karen Schindler HD055822 tarafından desteklenmektedir.

1. Fare oosit toplama <ol><li> Her fare izole antral folikül sayısını en üst düzeye çıkarmak için, intraperitoneal 5 IU gebe kısrak serum gonadotropini (PMSG) ile cinsel olgun dişi fareler enjekte (Harlan 6 haftalık CF-1 fareler). </li><li> 2.5 mcM milrinon ekleyerek toplama orta (MEM / PVP) (3 ml / fare) hazırlayın ve 37 sıcak ° C Milrinon oosit folikülleri çıkarılır kez mayotik tutuklama sağlayan bir fosfodiesteraz inhibitörüdür. Alternatif olarak, 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) (0.2 mM) veya dibutyryl siklik adenozin monofosfat (dbcAMP) (100 mg / ml) kullanılabilir. Glutamin (1 mM) ve milrinon (2.5 mcM), CZB 1 ml ekleyerek kültür ortamı hazırlayın ve en az bir saat için inkübatör gelmesini sağlayınız. Mineral yağ ile bir Petri kabı ve bindirme her microdrops ayarlayın. MEM / PVP çanak sıcak bir slayt dışında kalırken CZB çanak kuvöz içine yerleştirilir. (Özel ortam veya Sigma M2 ve M16) piyasada bulunan diğer toplama ve kültür ortamı, aynı zamanda düzenli olarak kullanılıyor. </li><li> Emişli PMSG Yaklaşık 48 saat sonra, CO 2 sedasyon servikal dislokasyon kullanarak fare kurban, yumurtalıkların incelemek ve önceden ısıtılmış MEM / PVP + milrinon (MEM / PVP + M) içeren bir Dürbün içine yerleştirin. </li><li> 1 ml insülin şırınga kullanarak, çanak yumurtalıkların çapa ve 27 gauge (veya dikiş) birbirine bağlanmış iğneler ile birkaç kez delinmesiyle antral foliküller bırakın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, ağız çalışan cam pipet kullanarak cumulus-oosit kompleksleri toplamak. Mikroskop kontrast çok yararlı olur. Alternatif olarak, doku ve hücreler içeren orta, bir plastik Petri kabı bir kapak pipetlenir olabilir. Sadece büyük antral foliküller ve küçük pre-antral folikülleri veya arındırılır oosit toplamak. Bir kez toplanan, sıcak slayt ve yağ altında MEM / PVP + M microdrop kompleksleri aktarın. </li><li> Küçük bir pipet kullanarak (oosit çapı biraz daha büyük) kompleksleri, kümülüs hücreleri ayırmak için pipet ve aşağı yukarı. Daha büyük bir CZB + milrinon (CZB + M) microdrop içine bir pipet ve inkübatör yer ile arındırılır oosit transfer. </li><li> Oosit manipülasyona inkübatör en az 1 saat önce kurtarmak için izin verin. </li></ol> 2. Oosit mikroenjeksiyon <ol><li> Mekanik bir çektirmenin borosilikat cam kapiller tüp çekerek enjeksiyon pipetler olun. P = 500, Isı = 300, çekin = 150, Vel = 100, Zaman = 150: Biz aşağıdaki ayarları ile Flaming-Brown mikropipet çektirmesi (Model P-97) kullanın. </li><li> 1-iyi bir odasına slayt seçim enjeksiyon malzemesi 0.5 ul damla (örneğin siRNA, Crna, morfolino oligonükleotid, vb) mümkün olduğunca yakın, MEM / PVP + M 5 ul damlatılarak mikroenjeksiyon platformu hazırlayın medya odası kaldırdı. Mineral yağ ve mikroskop sahnede yer (Şekil 1) ile kaplayın. </li><li> MEM / PVP + M. düşüş içine sahipleri ve pozisyon içine yerleştirin enjeksiyon ve tutma pipetler Picoinjector ve anti-vibrasyon masa bağlı nitrojen tankları açın. Orta ile doldururken holding pipet karşı hafifçe dokunarak enjeksiyon pipet ucu açın. Açılması çok büyükse, orta hızlı ve dışarı hareket edecek ve iğne hücre öldürecek. Çok küçük bir açılış ile Pipetler kolaylıkla tıkar. </li><li> Platform üzerinde MEM / PVP + M damla inkübatör transfer oosit (5-10). Enjekte önce picoinjector kurulum. PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7.8 psi, PClear = 10-12 psi, zaman = 3s: Biz bizim picoinjector (Model PLI-100 Harvard Apparatus) aşağıdaki parametreleri kullanın. Bu sonuçlar bir enjeksiyon hacmi 5-10 pL. </li><li> Temiz basarken, malzeme düşmesi, bir iğne taşımak ve dolgu. Orta damlasına kadar dönün. </li><li> Bir oosit yakalama ve x-ekseni boyunca enjeksiyon iğnesi, oosit ve pipet tutan hizalamak için holding pipet kullanın. </li><li> Yüksek büyütme altında, çekirdeğin önlemek için dikkatli olmak oosit yoluyla enjeksiyon pipet ilerlemek. Plazma zarı delinir sonra, ENJEKTE basın. Enjeksiyondan sonra iğne geri çekin. Oosit ve tekrar bırakın. Bir kez tüm oosit enjekte edilir, inkübatör dönün. Zaman istenilen miktarda CZB + M tutun; bu kez deneysel amacı (yani siRNA ve morfolino demonte (24 saat), aşırı ekspresyonu (3-12 saat)) bağlıdır. Lütfen 24 saat daha uzun inkubasyon mayotik olgunlaşma tehlikeye dikkat. </li></ol> 3. Oosit olgunlaşma <ol><li> Inkübasyon CZB birkaç damla (olgunlaşma orta) ile oosit yıkayın ve inkübatör petrol ve yer altında olgunlaşması orta microdrop transferinden sonra. </li><li> 16 saat tam olgunlaşma t için izin ver<html> o mayoz II metafaz. </li></ol> 4. Ploidi analizi <ol><li> CZB + monastrol (100 mcM) yeri ve dış halka su olan bir organ kültürü çanağı kuyuya 750 ul hazırlayın. </li><li> Yumurta, CZB + monastrol birkaç damla ile yıkayın ve organ kültürü çanak içine aktarabilirsiniz. 1 saat kuvöz koyun </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle PBS içinde% 2 paraformaldehid içeren bir Dürbün içine aktararak yumurta sabitleyin. Çözümü engelleme başka bir Dürbün içine aktarın. Bu yemek, işlenmiş ° C ye kadar 4 saklanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir Dürbün permeabilization solüsyonu (PBS +% 0.3 BSA +% 0.1 TritonX-100 +% 0.02 NaN 3) aktarın. Çözümü engelleme birkaç geniş hacimli ile durulayın (PBS +% 0.3 BSA + 0.01 Tween 20 +% 0.02 NaN 3). </li><li> Prosedürün geri kalan kısmı, oda sıcaklığında, ışıktan korumalı nemlendirilmiş bir odasında bir 96 plaka kapağı yapılır. Damla (~ 25 ul) dairesel girintileri içinde yerleştirilir. 15 dakika boyunca çözüm engelleme yumurta transferi. </li><li> Etiket sentromerlere, 01:40 anti-serum CREST içeren engelleme çözümünün bir damla transfer yumurta. En az 1 saat inkübe , Her biri 15 dakika inkübe engelleme çözümünün 3 damla ile yıkayın. </li><li> Cy5 veya Alexa-flor-594-konjuge anti-insan IgG (1:200) ve 1s inkübe içeren engelleme çözümünün bir damla yumurta transferi. Son adım dışında yukarıdaki adımları yıkama tekrarlayın, kromozom tespit etmek için engelleme çözümü Sytox Yeşil (1:5,000) içerir. Mount Vectashield 5 ul. Yumurta kırma önlemek için vazelin lamel nerede olacak köşelerinde 4 küçük noktalar koyun. Üst ve tırnak cilası ile mühür lamel yerleştirin. 4 slayt kutusunda saklayın ° C konfokal mikroskobi ile işleme kadar. </li><li> 100X amacı ile görüntüleme iken, Z-düzlem ve görüntü metafaz mili tüm bölgenin 0.4 mikron adımları yakalamak. Resim J (NIH) gibi görüntüleme yazılımı kullanarak sentromerlere güvenin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2, Z-euploid bir yumurtadan bir projeksiyon. MII, metafaz, euploid fare yumurtaları 20 çift kromozom içerir ve bu nedenle 40 sentromerlere var. Bazen kromozom monastrol tedaviye rağmen yaymak için başarısız olur. Bu durum zor güvenilir sentromerlere saymak ve bu nedenle analizlerde bu yumurta içermez yapar. Bazen, bir CREST immunoreaktif &quot;spot&quot; 1 ya da 2 sentromerlere olup olmadığını belirlemek için zor olabilir. Kromozom yönünü dikkatle not ise biri her Z-kesit analiz, çünkü Görüntü J gibi programları kullanarak yararlı, bir &quot;nokta&quot; tespit edildiği bölümler ve piksel yoğunluğu &quot;noktalar&quot; var. Mayotik mili kutup vücudun göre konumlandırılmış bağlı olarak, DNA bölgeleri üst üste ve bu numuneler analize dahil edilmemelidir. Unmanipulated anöploidi oranının düşük (~% 1-2), üreme genç farelerde in vivo ovulasyon yumurta var. Ancak, nedenleri anlaşılamamıştır, mikroenjeksiyon ve in vitro olgunlaşma prosedürler bu oranı yukarı% 10 artırabilir . Bu nedenle, herhangi bir mikroenjeksiyon çalışma kontrolü enjekte oosit dahil olduğu kritik öneme sahiptir. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Mikroenjeksiyon çanak kurmak. Sadece enjeksiyon çözüm 0.5μl damla üzerinde MEM / PVP + M 5 ul damla odasına doğru kaydırın. Mineral yağ ile kaplayın. Bu örnekte 3, 3 farklı enjeksiyon çözümler için damla ve slayt mikroskop sahnede oturan vardır. Mikroenjeksiyon iğne ve sağa sola tutarak pipet. Iğnelikler bir yansıması olduğunu unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Ploidi sonuçları. Euploid metafaz II yumurta A dan Z ye projeksiyon. DNA yeşil renkli ve eski haline döner, kırmızı renklidir. Oklar ki eski haline döner (# 17 ve # 18) örtüşme gösteren 2 ayrı kromatid silah. Euploid fare yumurtaları kinetochore 20 çift (toplam 40 &quot;noktalar&quot;) içerir. Anöploid yumurta bu sayı üzerinde herhangi bir değişiklik içerir. Bu yordamı metafaz MI oosit yapılmış olsaydı, 40 kinetochore çift (toplam 80 &quot;noktalar&quot;) olmazdı. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tablo 1"/> Tablo 1. Reçete toplama ve mikroenjeksiyon orta için (MEM / PVP + M). Tüm malzemeler embriyo kültür notu ve Sigma-Aldrich. 4 0.22μm PVDF filtreleri (biz Milipore Stericups) ve mağaza ° C ile sterilize Filtre iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; Tablo 2 &quot;/&gt; Tablo 2. CZB orta Tarif. Tüm malzemeler embriyo kültür notu ve Sigma-Aldrich. 4 0.22μm PVDF filtreleri (biz Milipore Stericups) ve mağaza ° C ile sterilize Filtre

<ol>
	<li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li><li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oogenesis and the control of meiotic maturation. , (1986).</li><li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li><li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li><li>Schindler, K., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20 (17), 1522-1522 (2010).</li><li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li><li>Stein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li><li>Stein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li><li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li><li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li><li>Schindler, K., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li><li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li><li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li></ol>

Mikroenjeksiyon oositlerin mayotik olgunlaşma 10,11, 12, 13 düzenleyen mekanizmalar çalışmak için güçlü bir yöntemdir . Bu yöntem ve hedefli transgenik fare modelleri, gelişmekte olan büyük bir yatırım yapmadan önce, hipotezleri test etmek için ekonomik bir yol sağlar. Oosit toplama ve mikroenjeksiyon teknikleri tipik hücre biyolojisi prosedürleri daha master için daha fazla zaman gerektirir. Koleksiyonu ile Özel engeller genellikle koleksiyonu için uygun büyüklükte cam pipet çekerek ve somatik hücre sıyırma ve oosit inkübatör dışında olduğu zaman en aza indirmek için toplama hızını artırarak, ağız pipet kontrol içerir. Biz deneyler yapmak için önce pek çok kez pratik tavsiye ederiz. Aynı sayıda hücre korurken microdrops arasında oosit aktarma, bu yöntem ile rahat olmak için harika bir yoldur. Mikroenjeksiyon öğrenme sırasında hücre ölümü görülür. Bu enjeksiyon iğne ile oosit karşı tarafında piercing çekirdeği isabet nedenlerle çok büyük bir malzeme hacmi (yani bir iğne açılması çok büyük) enjeksiyonu da dahil olmak üzere bir dizi,, ya da meydana gelebilir enjekte edilen malzeme oosit için zehirlidir. Hayatta kalma oranı en az% 50 kadar oosit içine enjekte tampon Uygulama mastering bu tekniğin önemli. Oosit olgunlaşması için başarısız olursa milrinon yeterince seyreltilmiş olmadığını muhtemeldir. Biz olgunlaşma önce milrinon ücretsiz CZB çok büyük damlalar yoluyla oosit durulama önerilir. Ploidi analizi aşağıdaki mikroenjeksiyon mayotik olgunlaşma değerlendirmek için birçok testlerinin biridir. Laboratuvarda kullanan diğer rutin analizler kinetiği izleme mili oluşumu ve kromozom uyum ve yumurta aktivasyonu analiz ya da in vitro fertilizasyon oosit manipülasyon 14,15 gelişimsel sonuçları, 16 değerlendirmek için immünofloresan mayoz yoluyla oosit ilerleme, 17.

Özel reaktifler Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Milrinon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> 2.5mm az DMSO içinde süspanse edin </td></tr><tr><td> Madeni yağ </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Sadece embriyo test edilmiş, steril filtrelenmiş kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Yeşil </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> 100 mM az DMSO içinde süspanse edin </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Özel ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Ağızlık </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Dürbün </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm Petri Dish </td><td> Şahin </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Cam Pasteur pipetleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Yan sıcak </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td></td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Odası Slayt </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Kılcal Boru </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> Pipet Çektirme </td><td> Flaming-Brown mikropipet çektirmesi </td><td></td><td> Model P-97 </td></tr><tr><td> Ters mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Mikromanipülatörler </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Model PLI-100 </td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> CO 2 tank </td><td></td><td></td><td> Inkübatör için </td></tr><tr><td> N2 tankı </td><td></td><td></td><td> Masa ve enjektör için </td></tr><tr><td> Anti-titreşim tablosu </td><td> Teknik Üretim </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Kuvöz </td><td></td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Holding pipetler </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları </td><td> Güzel bilim araçları </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Nemlendirilmiş haznesi </td><td></td><td></td><td> Biz tupperware </td></tr><tr><td> 96 plaka, Kapak </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Thomas bilimsel </td><td> 6663-F10 </td><td> Kalınlığı özel mikroskoplar için değişecektir </td></tr><tr><td> Merkezi iyi organ kültürü çanak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 x 15mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

Kromozom segregasyon hatalar anöploid hücrelere yol. Somatik hücre, anöploidi kanseri ile ilişkili ama gamet, anöploidi Down sendromu gibi kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar yol açar. Haploid gametlerin mayoz bölünme ile birleştiğinde türe özgü gelişim programları aracılığıyla oluşturur. Kromozomlar ayrı, kardeş kromatidler bağlı kalır çünkü ilk mayoz bölünme (MI) mayoz için eşsizdir. Reductional bölümü tam olarak anlaşılamamış nedenlerden dolayı, bu hataları eğilimli ve daha yaygın hataları daha mayoz II (MII) ya da erkek mayoz 1,2 hataları daha anöploidi kaynağıdır . Memelilerde, büyük, sağlam germinal vezikül (GV; nükleus) profaz MI oosit tutuklama ve ovulatuar ipuçları aldığınızda sadece mayoz devam. Bir kez mayoz bölünme devam eder, oosit tam MI ve MII, metafaz tekrar yakalama, asimetrik hücre bölünmesi tabi. Yumurta, sperm tarafından döllenmiş kadar MII tamamlayacak. Oosit in vitro kültür koşullarında 3 kurulan mayotik olgunlaşma tabi. Ve gen-hedefli transgenik fare mutantlar üretimi pahalı ve uzun süre alabilir, çünkü in vitro dişi gamet manipülasyonu daha ekonomik ve zaman tasarrufu sağlayan bir stratejidir. Burada, fareler ve mikroenjeksiyon için profaz-tutuklandı oosit izole etmek için yöntemler açıklanmaktadır. Herhangi bir malzeme tercih oosit içine tanıtıldı olabilir, ama yetkili meiotically-oosit 4,5 Crna değil, DNA transkripsiyonel sessiz çünkü, ektopik ifade çalışmaları için enjekte edilmelidir. Ploidi değerlendirmek için, MII yumurta oositlerin in vitro olgunlaşma için koşulların tanımlanması. Tarihsel, kromozom yayılan teknikleri, kromozom sayısı 6 saymak için kullanılır . Bu yöntem teknik olarak zordur ve sadece hyperploidies belirlenmesi amacıyla sınırlıdır. Burada, hipo-ve sağlam yumurta 7-8 kullanarak hyperploidies belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bipolar, iğsi 9 böylece ayıran kromozom bireysel eski haline döner, anti-CREST otoimmün serum kullanılarak kolayca algılanır ve sayılacaktır ki bir monopolar mili içine çöker kinesin-5 inhibitörü, monastrol kullanır . Çünkü bu yöntem sağlam yumurta, kromozomlar, operatör hatası nedeniyle kaybolmuş değildir.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment at JoVE.com

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Video: Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biyoloji

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik Üretimi<em&gt; Hydra</em&gt;: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...