우리는 농균 균주를 제공한 Jiří Macas(Biology Centre CAS, České Budějovice, Czech Republic)를 인정합니다. CEITEC MU의 핵심 시설 식물 과학은 기술 지원으로 인정 받고 있습니다. 이 작업은 체코 교육청소년체육부(Ministry of Education, Youth and Sports)의 유럽 지역 개발 기금 프로젝트 "SINGING PLANT"(no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) 및 INTER-COST 프로젝트 LTC20004.

Agrobacterium-mediated Hairy Root Induction and Regeneration in Plants(식물의 Agrobacterium 매개 털뿌리 유도 및 재생)

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계 없이 수행되었음을 선언합니다.

우리는 털이 많은 뿌리 변형과 B. napus와 A. thaliana의 후속 재생을 위한 간단한 프로토콜을 개발했습니다. 이 과정에는 자엽(B. napus) 또는 1차 꽃차례 줄기(A. thaliana)에 주사 기반 털이 많은 뿌리 유도가 포함됩니다. Ri 플라스미드를 운반하는 농균 균주 C58C1을 하이포코틸에 주입하는 방법은 본 연구에서 제시된 Brassicaceae 구성원 외에도 Fabaceae계열 10,11에서도 효과적이었습니다.
주입 기반 방법의 대안은 박테리아 현탁액에 식생 침지, 그리고 농균과 외식의 공동 배양으로 구성된 침지 기반 형질전환입니다. 침지 방법에 비해 주입 기반 방법의 장점은 일부 프로토콜 단계(예: 식재 준비, 공동 재배 시간 테스트, 털이 많은 뿌리 유도를 위한 호르몬 함유 배지에 대한 배양)가 없어 시간이 절약된다는 것입니다. 두 접근법 모두 털이 많은 뿌리 유도에 효과적이지만, 일부 종에서는 주입 기반 방법을 사용하여 식물 침지12,13에 비해 더 높은 형질 전환 효율이 관찰되었습니다. 또한, 주입 기반 형질전환은 복합 식물(형질전환 털뿌리 및 야생형 새싹)을 생성하는 데에도 유용합니다. 형질전환된 식물의 원래 뿌리를 잘라낸 후, 털이 많은 뿌리는 식물의 성장을 지원하며, 전이유전자는 전체 식물의 맥락에서 연구될 수 있습니다.
털이 많은 뿌리 유도의 중요한 단계는 hypocotyl 또는 1 차 꽃차례 줄기에 접종물을 주입하는 것입니다. B. napus 의 hypocotyls는 부서지기 쉬우며 전체 hypocotyl을 쉽게 절단할 수 있습니다. 꽃차례 줄기가 얇기 때문에 A. thaliana 에서도 동일하게 관찰 할 수 있습니다. 다른 종/품종의 형질전환 효율 비교가 필요한 경우 식물 주입 시 조작 및 기술로 인한 오류를 피하기 위해 한 사람이 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
우리는 B. napus DH12075 및 A. thaliana Col-0에서 털이 많은 뿌리 재생을 위한 효과적인 프로토콜을 개발했습니다. 재생은 매우 가변적인 과정이기 때문에, 일부 프로토콜 변형은 선택한 종 또는 품종에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 털이 많은 뿌리 유래 새싹은 B. oleracea14에서 다른 옥신/사이토키닌 비율(1:1)에 의해 유도될 수 있습니다. 대안적으로, B. campestris 털뿌리의 경우와 같이 BAP 대신에 시토키닌 티디아주론을 사용할 수 있다15.
식물 게놈에 Ri 플라스미드 T-DNA를 여러 번 삽입하는 것은 털이 많은 뿌리 형질전환 및 재생 시스템의 잠재적 한계를 나타냅니다. 이러한 경우, T1 묘목의 분리 분석 후 Ri 플라스미드에서 TL/TR이 없는 식물은 발견되지 않습니다. 따라서 각 전이유전자에 대해 여러 개의 독립적인 털이 많은 뿌리줄기를 생성하는 것이 좋습니다.
털이 많은 뿌리 배양은 주로 빠른 설립과 저렴한 유지 관리(재배 배지에 호르몬이 필요하지 않음) 때문에 유전자 기능 연구를 위한 매우 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 B. napus 및 A. thaliana의 털이 많은 뿌리 유도 및 재생 방법을 다루며, 이는 복합 식물을 사용하는 전체 식물의 맥락에서 또는 형질전환 식물의 재생 후 털이 많은 뿌리 배양에서 직접 관심 있는 전이유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

식물 형질전환은 식물 생물학의 모든 유전학 연구의 병목 현상입니다. 토양 매개 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens는 형질전환체를 생성하기 위해 꽃 딥 또는 조직 배양에 의한 유전자 전달 수단으로 널리 사용됩니다. A. tumefaciens는 상처 부위의 식물을 감염시키고 종양 유도(Ti) 플라스미드에서 숙주 식물 게놈으로 T-DNA를 전달하고 통합하여 종양을 유발합니다. 야생형 T-DNA가 없는 변형된 Ti 플라스미드와 인공 T-DNA가 있는 이진 벡터를 가진 공학적 A. tumefaciens 균주와 관심 유전자를 삽입하기 위한 클로닝 부위가 효율적인 식물 형질전환 시스템으로 일반적으로 사용된다1. 그러나 많은 모델 종과 작물은 플로럴 딥 또는 체외 식물 재생에 소극적이거나 성장 주기가 길어 이 형질 전환 시스템의 효율성에 영향을 미칩니다.
Agrobacterium rhizogenes는 숙주 식물을 감염시킨 후 상처 부위에 우발성 뿌리 또는 털이 많은 뿌리의 형성을 유도합니다. A. tumefaciens와 유사하게, A. rhizogenes는 Root-inducing (Ri) plasmid에서 숙주 식물 게놈으로 T-DNA를 전달하여 형질전환 털이 많은 뿌리의 발달을 유발합니다. 이 과정은 주로 뿌리 발암 유전자좌(Root Oncogenic loci, rol) 유전자 2,3에 의해 제어됩니다. Ri 플라스미드와 관심 유전자를 인코딩하는 인공 이진 벡터를 모두 운반하는 농균 균주를 사용하여 털이 많은 뿌리 배양액을 사용하여 재조합 단백질을 생산하거나, 프로모터 또는 유전자의 기능을 분석하거나, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6을 사용하여 게놈을 편집했습니다.
당사의 프로토콜은 Ri 플라스미드 pRiA4b7을 운반하는 transconjugant 균주 Ti-less A. tumefaciens C58C1을 사용합니다. Ri 플라스미드의 T-DNA는 식물 게놈8에 독립적으로 통합될 수 있는 우측 및 좌측 T-DNA (TR-DNA 및 TL-DNA)의 두 영역으로 구성된다. 이 시스템을 활용하여 Brassica napus DH12075 품종의 긴 외식 형질 전환 과정을 최적화했습니다9. 아래에 자세히 설명된 프로토콜은 선택된 털이 많은 뿌리 계통의 재생을 허용하고 약 1년 내에 관심 있는 전이 유전자를 운반하고 rol 유전자가 없는 T1 식물을 얻을 수 있습니다. 주입 기반 털뿌리 형질전환은 애기장대(Arabidopsis thaliana Col-0)를 형질전환시킴으로써 알 수 있듯이 다른 Brassicaceae 종에서 사용할 수 있습니다. hypocotyl은 B. napus를 변형시키는 데 사용되지만 A. thaliana는 1 차 꽃차례 줄기에 주입됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

털 뿌리 형질전환은 다양한 종의 식물 생명공학을 위한 다재다능한 도구입니다. 뿌리 유도(Ri) 플라스미드를 운반하는 아그로박테리움 균주에 의한 감염은 Ri 플라스미드에서 식물 게놈으로 T-DNA를 전달한 후 상처 부위에 털이 많은 뿌리의 형성을 유도합니다. 이 프로토콜은 Brassica napus DH12075 및 Arabidopsis thaliana Col-0에서 주사 기반 털뿌리 유도 절차를 자세히 설명합니다. 털이 많은 뿌리는 관심있는 전이 유전자를 분석하는 데 사용되거나 형질 전환 식물의 생성을 위해 처리 될 수 있습니다. 사이토키닌 6-벤질아미노퓨린(5mg/L)과 옥신 1-나프탈렌아세트산(8mg/L)을 함유한 재생 배지는 두 종 모두에서 성공적으로 싹 형성을 유도합니다. 이 프로토콜은 Ri 플라스미드에서 T-DNA가 없는 관심 전이유전을 운반하는 식물을 얻기 위한 생식제 및 T1 식물의 유전형 분석 및 선택을 다룹니다. 복합 플랜트의 형성으로 이어지는 대체 공정도 묘사되어 있습니다. 이 경우 털이 많은 뿌리는 (자연 뿌리 대신) 싹에 유지되어 전체 식물의 맥락에서 털이 많은 뿌리 배양에서 전이 유전자를 연구 할 수 있습니다.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

저자 스포트라이트: Optimization Hairy Root-based Transformation Protocols for Enhanced Efficiency in Brassicaceae

Arabidopsis thaliana와 Brassica napus의 털이 많은 뿌리 변형 및 재생

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

우리는 이전에 Brassica napus의 세 가지 품종, 즉 DH12075, Topas DH4079 및 Westar9에서 주사 기반 털이 많은 뿌리 유도를 위한 프로토콜을 최적화했습니다. 이 형질 전환 프로토콜을 모델 종 A. thaliana에 적용하기 위해 1개월 된 묘목의 1차 꽃차례 줄기에 농균 접종물을 주입했습니다. 털이 많은 뿌리는 2-4 주 후에 주사 부위에 나타났습니다. 털이 많은 뿌리를 절제하고 고체 배지에서 재배했습니다. 이 두 종의 방법을 비교한 것은 그림 1에 나와 있습니다.
선택된 털이 많은 뿌리 라인을 재생 배지로 옮겨 새싹 형성을 유도했습니다. A. thaliana에서, 노란색 캘리는 14 일 이내에 10 개의 털이 많은 뿌리 계통 모두에서 유도되었습니다. 첫 번째 싹 primordia는 재생 배지로 옮긴 후 3주 이내에 짙은 녹색 반점으로 나타납니다(그림 2). 4주간의 배양 후, 싹은 10개의 털이 많은 뿌리 계통 중 9개의 털이 많은 뿌리를 덮었습니다(90% 재생 효율). 어떤 경우에는 굳은살에서 외래 뿌리가 유도되었습니다(그림 2H). 재생 배지에서 3개월이 지나도 한 줄이 재생되지 않았습니다(4주마다 털이 많은 뿌리를 새로운 배지로 옮겼습니다). 따라서 A. thaliana 털뿌리의 재생 효율은 B. napus DH120759의 효율과 유사하다.
B. napus와 A. thaliana의 털이 많은 뿌리 재생제는 왜소한 표현형을 나타내는데(그림 3), 이는 털이 많은 뿌리 유래 식물의 전형적인 특징이다2. 우리는 또한 빽빽한 뿌리 시스템, 주름진 잎, 개화 시기의 변화를 관찰했습니다. 이 소위 털이 많은 뿌리(또는 Ri) 표현형은 식물 게놈에 삽입된 Ri 플라스미드의 rol 유전자에 의해 발생합니다. 이진 벡터 상에 인코딩된 Ri T-DNA와 전이유전자의 삽입은 독립적이거나 연결될 수 있다. 따라서, 자가수분에 의해 생성된 T1 자손의 분리 분석은 관심의 전이유전자를 발현하는 롤이 없는 식물을 식별하는 데 도움이 됩니다. T1 식물의 유전형 분석은 TL 및 TR의 ORF와 관심 전이유전자에 특이적인 PCR 프라이머에 의해 수행됩니다. 농균 오염의 부재는 virC 프라이머의 PCR 산물의 부재에 의해 검증됩니다(그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> 그림 1: A. thaliana 와 B. napus의 절차 요약. 자엽 또는 1차 꽃차례 줄기에 Agrobacterium 접종물을 주입하면 털이 많은 뿌리의 발달을 유도합니다. 털이 많은 뿌리는 토착 뿌리를 대체하여 유전형을 분석하고 분석할 복합 식물을 생성할 수 있습니다(파란색 화살표). 배양된 털뿌리는 T0 식물로 재생되고, T1 식물에서 번식하고, 유전자형(녹색 화살표)으로 분석될 수 있습니다. 털이 많은 뿌리는 기능 분석을 위해 하위 배양할 수도 있습니다(검은색 화살표). 유전형 분석 결과의 예가 제시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> 그림 2: A. thaliana의 털이 많은 뿌리의 재생. (A) 털이 많은 뿌리 배양 1 일 후 플레이트로 옮깁니다. (나, 씨) Calli는 재생 배지에서 배양 후 2주 이내에 개발되었습니다. (디, 마) 슛 프리모르디아는 3주간의 배양 끝에 등장했습니다. (지, H) 싹은 4 주 후에 형성됩니다. (H) 굳은살에서 발달한 외래 뿌리. (씨, 에프, 나) 재생되지 않는 털이 많은 뿌리 라인. 축척 막대는 1cm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> 그림 3: B. napus 및 A. thaliana 의 야생형 식물과 털이 많은 뿌리 유래 재생제(T0 식물)의 대표 사진. 재생제의 Ri 표현형에 주목하십시오. 축척 막대는 2cm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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이 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis) 1차 꽃차례 줄기와 Brassica napus hypocotyls를 사용한 털이 많은 뿌리 유도를 설명합니다. 털이 많은 뿌리는 배양되어 형질 전환 식물을 재생하기 위한 이식 식물로 사용될 수 있습니다.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

우리의 연구는 Brassicaceae의 효율적인 변형을 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 모근 기반 변형을 사용하여 Brassica napus의 변형 효율성을 획기적으로 개선했으며, 이는 연구에 매우 중요합니다. 우리는 또한 모델 종인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 프로토콜을 테스트했습니다.우리는 Brassica napus에서 DH12075 봄 품종에 대한 프로토콜을 최적화했습니다. 다음 과제는 Brassica napus와 Brassica rapa 및 Brassica oleracea의 겨울 품종의 변형 및 재생 프로토콜을 최적화하는 것입니다. 털이 많은 뿌리는 쉽게 번식할 수 있으며, 빠른 성장으로 인해 형질전환 직후 관심 유전자를 신속하게 분석할 수 있습니다.결과적으로, 원하는 형질을 나타내는 특정 털이 많은 뿌리 라인을 선택적으로 재생하는 것이 가능해집니다. 예를 들어, CRISPR-Cas에 의해 도입된 유전자 돌연변이가 있습니다.

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Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K 조회수.  Masaryk University. 우리의 연구는 Brassicaceae의 효율적인 변형을 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 모근 기반 변형을 사용하여 Brassica napus의 변형 효율성을 획기적으로 개선했으며, 이는 연구에 매우 중요합니다. 우리는 또한 모델 종인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 프로토콜을 테스트했습니다.우리는 Brassica napus에서 DH12075 봄 품종에 대한 프로토콜을 최적화했습니다. 다음...