אנו מודים ל-Jiří Macas (המרכז הביולוגי CAS, České Budějovice, צ'כיה) על אספקת הזן האגרובקטריאלי. מדעי צמחי מתקן הליבה של CEITEC MU מוכרים בזכות התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ'כית עם הקרן האירופית לפיתוח אזורי - פרויקט "SINGING PLANT" (לא. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) ופרויקט INTER-COST LTC20004.

השראת שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום והתחדשות בצמחים

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא כל יחסים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

פיתחנו פרוטוקול פשוט להתמרת שורשים שעירים והתחדשות לאחר מכן ב-B. napus וב-A. thaliana. תהליך זה כולל השראת שורש שעיר על בסיס הזרקה בהיפוקוטיל (B. napus) או בגזע התפרחת הראשוני (A. thaliana). השיטה של הזרקת hypocotyl עם זן אגרובקטריאלי C58C1 הנושא פלסמיד Ri היה יעיל גם במשפחת Fabaceae10,11, מלבד חברי Brassicaceae שהוצגו במחקר זה.
חלופה לשיטה מבוססת הזרקה היא טרנספורמציה מבוססת טבילה המורכבת מטבילה explant בתרחיף חיידקי, ואחריו טיפוח משותף של explant עם אגרובקטריה. היתרון של השיטה מבוססת ההזרקה על פני שיטת הטבילה הוא הזמן שנחסך על ידי היעדר כמה שלבי פרוטוקול: הכנת אקספלנט, בדיקת זמן הטיפוח המשותף, ותרבית על מדיום המכיל הורמון להשראת שורשים שעירים. למרות ששתי הגישות יעילות להשראת שורשים שעירים, יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר נצפתה במינים מסוימים בשיטה מבוססת הזרקה בהשוואה לטבילה בצמח12,13. יתר על כן, טרנספורמציה מבוססת הזרקה שימושית גם ליצירת צמחים מרוכבים (שורשים שעירים טרנסגניים ונבטים מסוג בר). לאחר כריתת השורשים המקוריים של הצמח שעבר טרנספורמציה, שורשים שעירים תומכים בצמיחת הצמח, וניתן לחקור את הטרנסגן בהקשר של הצמח כולו.
השלב הקריטי של השראת שורש שעיר הוא הזרקת האינקולום לתוך ההיפוקוטיל או גזע התפרחת הראשוני. ההיפוקוטיל של B. napus ניתן לשבירה, וחיתוך ההיפוקוטיל כולו יכול לקרות בקלות. אותו הדבר ניתן לראות עם A. thaliana בגלל דקיקות גזע התפרחת. אם נדרשת השוואה של יעילות הטרנספורמציה של זנים / זנים שונים, אנו ממליצים לאדם אחד לבצע את כל הניסויים כדי למנוע את השגיאה הנגרמת על ידי מניפולציה ומיומנות בהזרקת הצמחים.
פיתחנו פרוטוקול יעיל להתחדשות שורשים שעירים ב-B. napus DH12075 וב-A. thaliana Col-0. מכיוון שהתחדשות היא תהליך משתנה מאוד, כמה שינויי פרוטוקול עשויים להיות מיושמים על מין או זן לפי בחירה. לדוגמה, הנבטים השעירים שמקורם בשורש יכולים להיווצר על ידי יחס אוקסין/ציטוקינין שונה (1:1) ב-B. oleracea14. לחלופין, ניתן להשתמש בציטוקינין תידיאזורון במקום BAP, כמו במקרה של B. campestris שורשים שעירים15.
החדרות מרובות של T-DNA פלסמיד Ri לגנום הצמח מייצגות מגבלה פוטנציאלית של מערכת הטרנספורמציה וההתחדשות של השורש השעיר. במקרים כאלה, צמחים ללא TL/TR מפלסמיד Ri אינם נחשפים לאחר ניתוח הפרדה של שתילי T1. לכן, אנו ממליצים ליצור מספר קווי שורש שעירים עצמאיים עבור כל טרנסגן.
תרביות שורשים שעירים הן כלי רב עוצמה למחקרים תפקודיים גנטיים בעיקר בגלל התבססותן המהירה ותחזוקתן הזולה (אין צורך בהורמונים באמצעי הטיפוח). פרוטוקול זה מכסה את השיטות להשראת שורשים שעירים והתחדשות ב- B. napus ו- A. thaliana, שניתן להשתמש בהן כדי לחקור את הטרנסגן המעניין ישירות בתרביות שורשים שעירים, בהקשר של הצמח כולו באמצעות צמחים מרוכבים, או לאחר התחדשות הצמחים הטרנסגניים.

טרנספורמציה של צמחים היא צוואר הבקבוק של כל מחקר גנטי בביולוגיה של הצמח. חיידק הנישא בקרקע, Agrobacterium tumefaciens, נמצא בשימוש נרחב כאמצעי להעברת גנים על ידי טבילת פרחים או תרבית רקמות ליצירת טרנספורמנטים. A. tumefaciens מדביק צמחים באתר פציעה וגורם לגידולים עקב העברה ואינטגרציה של T-DNA מפלסמיד גורם גידול (Ti) לגנום הצמח המארח. זני A. tumefaciens מהונדסים עם פלסמיד Ti שונה ללא T-DNA מסוג פראי ווקטור בינארי עם T-DNA מלאכותי ואתרי שיבוט להחדרת גן מעניין משמשים בדרך כלל כמערכת טרנספורמציה יעילה של צמחים1. עם זאת, מינים וגידולי מודל רבים עקשנים לטבילה פרחונית או התחדשות צמחים במבחנה או שיש להם מחזורי צמיחה ארוכים, מה שמשפיע על היעילות של מערכת טרנספורמציה זו.
קנה שורש אגרובקטריום גורם להיווצרות שורשים הרפתקניים, או שורשים שעירים, באתר הפציעה לאחר הדבקת צמח פונדקאי. בדומה ל- A. tumefaciens, A. rhizogenes מעביר T-DNA מפלסמיד השראת שורש (Ri) לגנום הצמח המארח, וגורם להתפתחות שורשים שעירים טרנסגניים. תהליך זה נשלט בעיקר על ידי הגנים השורשיים האונקוגניים (rol) 2,3. באמצעות זנים אגרובקטריאליים הנושאים הן את פלסמיד Ri והן וקטור בינארי מלאכותי המקודד גן מעניין, תרביות שורש שעירות שימשו לייצור חלבונים רקומביננטיים, ניתוח תפקודם של מקדמים או גנים, או עריכת גנומים באמצעות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
הפרוטוקול שלנו משתמש בזן טרנס-מצומד Ti-less A. tumefaciens C58C1 הנושא את פלסמיד Ri pRiA4b7. T-DNA של פלסמיד Ri מורכב משני אזורים, T-DNA ימין ושמאל (TR-DNA ו- TL-DNA, בהתאמה), שיכולים להשתלב באופן עצמאי בגנום הצמח8. תוך ניצול מערכת זו, תהליך הטרנספורמציה הארוך של explant ב-Brassica napus DH12075 cultivar עבר אופטימיזציה9. הפרוטוקול המפורט להלן מאפשר התחדשות של קווי שורשים שעירים נבחרים וקבלת צמחי T1 הנושאים את הטרנסגן המעניין וללא גנים של רול תוך כשנה. ניתן להשתמש בטרנספורמציית שורש שעיר מבוססת הזרקה במינים אחרים של Brassicaceae, כפי שמוצג על ידי שינוי Arabidopsis thaliana Col-0. בעוד hypocotyl משמש כדי להפוך B. napus, A. thaliana מוזרק לתוך גזע התפרחת הראשוני.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

טרנספורמציית שורשים שעירים מהווה כלי רב-תכליתי לביוטכנולוגיה של צמחים במינים שונים. זיהום על ידי זן אגרובקטריום הנושא פלסמיד השראת שורש (Ri) גורם להיווצרות שורשים שעירים באתר הפציעה לאחר העברת T-DNA מפלזמיד Ri לגנום הצמח. הפרוטוקול מתאר בפירוט את הליך השראת השורש השעיר מבוסס ההזרקה ב - Brassica napus DH12075 ו - Arabidopsis thaliana Col-0. השורשים השעירים עשויים לשמש לניתוח טרנסגן מעניין או מעובד ליצירת צמחים טרנסגניים. מדיום רגנרציה המכיל ציטוקינין 6-בנזילאמינופורין (5 מ"ג/ליטר) וחומצה אוקסין 1-נפתלנאצטית (8 מ"ג/ליטר) מעורר בהצלחה היווצרות נבטים בשני המינים. הפרוטוקול מכסה את הגנוטיפ והבחירה של רגנרנטים וצמחי T1 כדי להשיג צמחים הנושאים טרנסגן מעניין וללא T-DNA מפלסמיד Ri . מתואר גם תהליך חלופי המוביל להיווצרות צמח מרוכב. במקרה זה, שורשים שעירים נשמרים על הנבטה (במקום השורשים הטבעיים), מה שמאפשר לחקור טרנסגן בתרביות שורשים שעירים בהקשר של הצמח כולו.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Author Spotlight: אופטימיזציה של פרוטוקולי טרנספורמציה שעירים מבוססי שורשים לשיפור היעילות ב-Brassicaceae

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

בעבר ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול להשראת שורשים שעירים מבוססי הזרקה בשלושה זנים של Brassica napus, כלומר DH12075, Topas DH4079 ו-Westar9. כדי ליישם פרוטוקול טרנספורמציה זה על מין המודל A. thaliana, גבעולי התפרחת העיקריים של צמחים בני חודש הוזרקו עם חיסון אגרובקטריאלי. שורשים שעירים הופיעו במקום ההזרקה לאחר 2-4 שבועות. שורשים שעירים נכרתו וטופחו על התווך המוצק. השוואת השיטה בשני המינים האלה מתוארת באיור 1.
קווי שורש שעירים נבחרים הועברו למדיום ההתחדשות כדי לגרום להיווצרות נבטים. ב- A. thaliana, קלי צהוב הושרה תוך 14 יום בכל 10 קווי השורש השעירים שנבדקו. פרימורדיה ראשונית שנראתה ככתמים ירוקים כהים הופיעה תוך 3 שבועות לאחר העברתה למדיום ההתחדשות (איור 2). לאחר 4 שבועות של תרבית, הנבטים כיסו את השורשים השעירים ב-9 מתוך 10 קווי שורש שעירים (יעילות התחדשות של 90%). במקרים מסוימים, שורשים הרפתקניים נבעו מהיבלת (איור 2H). קו אחד לא התחדש גם לאחר 3 חודשים במדיום ההתחדשות (כל 4 שבועות הועברו השורשים השעירים למדיום טרי). לפיכך, יעילות ההתחדשות של שורשים שעירים A. thaliana דומה ליעילות של B. napus DH120759.
מחדשים שורשים שעירים של B. napus ו-A. thaliana מציגים פנוטיפ ננסי (איור 3), מאפיין אופייני של צמחים שמקורם בשורש שעיר2. ראינו גם מערכות שורשים צפופות, עלים מקומטים ושינויים בזמן הפריחה. הפנוטיפ הזה שנקרא שורש שעיר (או Ri) נגרם על ידי הגנים רול מפלסמיד Ri המוחדרים לגנום הצמח. החדרת ה-T-DNA של Ri והטרנסגן המקודד על וקטור בינארי עשויים להיות עצמאיים או מקושרים. לפיכך, ניתוח הפרדה של צאצאי T1 שנוצרו על ידי האבקה עצמית מסייע לזהות צמחים נטולי רול המבטאים את הטרנסגן המעניין. גנוטיפ של צמחי T1 מבוצע על ידי פריימרים PCR ספציפיים עבור ORFs של TL ו- TR ואת הטרנסגן של עניין. היעדר זיהום אגרובקטריאלי מאומת על-ידי היעדר מוצרי PCR של פריימרים virC (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> איור 1: סיכום ההליך ב-A. thaliana וב-B. napus. הזרקת Agrobacterium inoculum בגזע היפוקוטיל או תפרחת ראשונית גורמת להתפתחות שורשים שעירים. השורשים השעירים יכולים להחליף את השורשים המקומיים וליצור צמח מרוכב שיעבור גנוטיפ וינותח (חיצים כחולים). שורשים שעירים מתורבתים יכולים להתחדש לצמחי T0, להתפשט בצמחי T1 ולבצע גנוטיפ (חיצים ירוקים). השורשים השעירים יכולים גם להיות תת-תרבית לצורך ניתוח פונקציונלי (חץ שחור). מוצגות דוגמאות לתוצאות גנוטיפ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> איור 2: התחדשות שורשים שעירים ב-A. thaliana. (A) תרבית שורשים שעירים יום אחד לאחר העברתה לצלחות. (ב, ג) קאלי התפתחה תוך שבועיים מהתרבית במדיום ההתחדשות. (ד, ה) Shoot primordia יצא לאחר 3 שבועות של תרבות. (ז, ח) יורה נוצרים לאחר 4 שבועות. (H) שורשים הרפתקניים התפתחו מהיבלת. (ג, ו, ט) קו שורש שעיר שאינו מתחדש. פסי קנה מידה מייצגים 1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות של צמחי בר מסוג B. napus ו-A. thaliana ומחדשים שמקורם בשורשים שעירים (צמחי T0). שימו לב לפנוטיפ Ri של הרגנרנטים. פסי קנה מידה מייצגים 2 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus at JoVE.com

הפרוטוקול מתאר השראת שורשים שעירים באמצעות גבעולי תפרחת ראשוניים Arabidopsis והיפוקוטיל Brassica napus . ניתן לגדל את השורשים השעירים ולהשתמש בהם כצמחים להתחדשות צמחים טרנסגניים.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

המחקר שלנו נועד לפתח פרוטוקול לשינוי יעיל ב Brassicaceae. באמצעות טרנספורמציה מבוססת שורש שיער, שיפרנו באופן דרמטי את יעילות השינוי ב- Brassica napus, שהיא חיונית למחקר שלנו. בדקנו את הפרוטוקול גם במין מודל Arabidopsis thaliana.ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור זני אביב DH12075 ב-Brassica napus. האתגר הבא הוא לייעל את פרוטוקול הטרנספורמציה וההתחדשות של זני החורף ב-Brassica napus, כמו גם עבור Brassica rapa ו-Brassica oleracea. שורשים שעירים יכולים להתפשט בקלות, וצמיחתם המהירה מאפשרת ניתוח מהיר של הגן המעניין זמן קצר לאחר הטרנספורמציה.כתוצאה מכך, ניתן ליצור מחדש באופן סלקטיבי קווי שורש שעירים ספציפיים המציגים את התכונה הרצויה. לדוגמה, מוטציה גנטית שהוצגה על ידי CRISPR-Cas.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.1K Views.  Masaryk University. המחקר שלנו נועד לפתח פרוטוקול לשינוי יעיל ב Brassicaceae. באמצעות טרנספורמציה מבוססת שורש שיער, שיפרנו באופן דרמטי את יעילות השינוי ב- Brassica napus, שהיא חיונית למחקר שלנו. בדקנו את הפרוטוקול גם במין מודל Arabidopsis thaliana.ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור זני אביב DH12075 ב-Brassica napus. האת...

Video: Author Spotlight: אופטימיזציה של פרוטוקולי טרנספורמציה שעירים מבוססי שורשים לשיפור היעילות ב-Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

טרנספורמציית שורש שעיר בתיווך אגרובקטריום ב-Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

שיטות התחדשות וברירה עבור Brassica napus DH12075 Regenerants וצמחי T1

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.