Yazarlara verilen destek arasında Massachusetts General Hospital Pediatri Bölümü, Araştırma Geçici Destek Fonu İcra Komitesi (ISF) ödülü 2022A009041, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü hibe R21AI146405 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü Harvard'daki Beslenme Obezite Araştırma Merkezi (NORCH) 2P30DK040561-26. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Kolon Epitel Hücrelerinde Shigella Enfeksiyonunu Analiz Etmek için Protokoller

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu protokol, bağırsak epitel hücrelerinin Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için üç standart testi açıklar. Bu yöntemler, konakçı hücreler içindeki çeşitli bakteriyel patojenlerin invazyonunu ve hücre içi replikasyonunu incelemek için kullanılan klasik gentamisin testlerinin yalnızca değiştirilmiş versiyonları olsa da 49,50,51, Shigella'yı incelerken ...

Enterik bakteriyel patojenlerin neden olduğu ishalli hastalıklar önemli bir küresel sağlık yüküdür. 2016 yılında, ishalli hastalıklar dünya çapında 1,3 milyon ölümden sorumluydu vebeş yaşından küçük çocuklarda dördüncü önde gelen ölüm nedeniydi 1,2. Gram-negatif, enterik bakteriyel patojen Shigella, dünya çapında ishal ölümlerinin önemli bir nedeni olan shigellozun etken maddesidir3. Shigellosis her yıl düşük ve orta gelirli ülkelerdeki çocuklarda önemli morbidite ve mortaliteye neden olurken, 4,5 yüksek gelirli ülkelerdeki enfeksiyonlar kreş, gıda kaynaklı ve su kaynaklı salgınlarlabağlantılıdır 6,7,8,9. Etkisiz aşı geliştirme10 ve artan antimikrobiyal direnç (AMR) oranları11,12, büyük ölçekli Shigella salgınlarının yönetimini karmaşıklaştırmıştır. Son Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri verileri, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki Shigella enfeksiyonlarının yaklaşık %46'sının 2020'de ilaç direnci gösterdiğinigösteriyor 13,14, Dünya Sağlık Örgütü ise Shigella'yı acilen yeni tedavilere ihtiyaç duyulan AMR öncelikli bir patojen olarak ilan etti15.
Shigella enfeksiyonları, kontamine yiyecek veya suyun yutulması üzerine fekal-oral yolla veya doğrudan insan teması yoluyla kolayca bulaşır. Shigella, hastalığa neden olmak için yeterli 10-100 bakteri dozu ile verimli, insana uyarlanmış bir patojen olarak gelişmiştir16. İnce bağırsak geçişi sırasında Shigella, yüksek sıcaklık ve safra gibi çevresel sinyallere maruz kalır17. Bu sinyallerin saptanması, bakterilerin insan kolonunu enfekte etme yeteneğini artıran virülans faktörlerini ifade etmek için transkripsiyonel değişiklikleri indükler 17,18,19. Shigella, apikal yüzeyden kolon epitelini istila etmez, bunun yerine folikülle ilişkili epitel20,21,22 içindeki özel antijen sunan mikro kıvrım hücrelerine (M hücreleri) alımını takiben epitel tabakası boyunca geçiş yapar. Transsitozu takiben, Shigella hücreleri yerleşik makrofajlar tarafından fagosite edilir. Shigella hızla fagozomdan kaçar ve makrofaj hücre ölümünü tetikleyerek proinflamatuar sitokinlerin salınmasına neden olur 5,23,24. Shigella daha sonra bazolateral taraftan kolon epitel hücrelerini istila eder, makropinositik vakuolün parçalanması ve sitoplazmada replikatif bir niş oluşturur 5,25. Pro-inflamatuar sitokinler, özellikle interlökin-8 (IL-8), polimorfonükleer nötrofil lökositleri (PMN'ler) enfeksiyon bölgesine toplar, bu da epitelyal sıkı bağlantıları zayıflatır ve bazolateral enfeksiyonu şiddetlendirmek için epitel astarının bakteriyel infiltrasyonunu sağlar5. PMN'ler, enfeksiyonu kontrol altına almak için enfekte epitel astarını tahrip eder, bu da basiller (kanlı) dizanteri5'in karakteristik semptomlarına neden olur. İnvazyon ve hücre içi replikasyon mekanizmaları kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, yeni araştırmalar Shigella enfeksiyonunda gastrointestinal (GI) geçiş sırasında virülans regülasyonu17, aderans19, bariyer geçirgenliği26 yoluyla gelişmiş bazolateral erişim ve yetersiz beslenen çocuklarda asemptomatik taşıma27 dahil olmak üzere önemli yeni kavramları göstermektedir.
Shigella spp.'nin ishal hastalığına neden olma yeteneği insanlar ve insan olmayan primatlarla sınırlıdır (NHP)28. Zebra balığı 29, fareler30, kobaylar31, tavşanlar21,32,33 ve domuzlar34,35 için Shigella bağırsak enfeksiyonu modelleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu model sistemlerin hiçbiri, insan enfeksiyonu sırasında gözlemlenen hastalık özelliklerini doğru bir şekilde kopyalayamaz36. Shigella patogenezini incelemek için NHP shigellosis modelleri oluşturulmuş olsa da, bu model sistemlerin uygulanması pahalıdır ve insanların enfeksiyöz dozundan dokuz kat daha yüksek olan yapay olarak yüksek enfeksiyöz dozlar gerektirir 37,38,39,40,41,42. Bu nedenle, Shigella'nın insan konakçıların enfeksiyonu için dikkate değer adaptasyonu, Shigella patogenezinin doğru bir şekilde sorgulanması için fizyolojik olarak ilgili modelleri yeniden oluşturmak için insan kaynaklı hücre kültürlerinin kullanılmasını gerektirir.
Burada, HT-29 kolonik epitel hücrelerinde Shigella'nın yapışması, invazyonu ve replikasyon oranlarını ölçmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokoller kullanılarak, bakteriyel virülans genlerinin ve çevresel sinyallerin Shigella enfeksiyonunun her adımını etkilediği moleküler mekanizmalar, dinamik konakçı-patojen etkileşimi ilişkisini daha iyi anlamak için sorgulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PES filter</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td>17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>Plates are treated for optimal cell attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8756</td>
			<td>1:1 ratio of cholate to deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>A benzidine-based anionic diazo dye, &#62;85% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>To be used with the Countess Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A a highly polar organic reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat-inactivated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632</td>
			<td>Stock concentration is 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td>Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td>Laboratory sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1x concentration; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>30391023</td>
			<td>A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>A common non-ionic surfactant and emulsifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8907</td>
			<td>Bacterial growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epithelial cell infection analyses with shigella

İnsan tarafından uyarlanmış enterik bakteriyel patojen Shigella, her yıl milyonlarca enfeksiyona neden olur, pediatrik hastalar arasında uzun vadeli büyüme etkileri yaratır ve dünya çapında ishal ölümlerinin önde gelen nedenidir. Enfeksiyon, patojenin gastrointestinal sistemden geçmesi ve kolonu kaplayan epitel hücrelerini enfekte etmesi sonucu sulu veya kanlı ishale neden olur. Antibiyotik direncindeki şaşırtıcı artışlar ve onaylanmış aşıların mevcut eksikliği nedeniyle, standartlaştırılmış araştırma protokolleri bu zorlu patojeni incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada, kolonik epitel hücrelerinde bakteriyel aderans, invazyon ve hücre içi replikasyonun in vitro analizlerini kullanarak Shigella'nın moleküler patogenezini incelemek için metodolojiler sunulmaktadır. Enfeksiyon analizlerinden önce, Shigella kolonilerinin virülans fenotipi, Kongo kırmızı boyasının agar plakalarına alınmasıyla doğrulandı. Takviye edilmiş laboratuvar ortamı, in vivo koşulları taklit etmek için bakteri kültürü sırasında da düşünülebilir. Bakteri hücreleri daha sonra, enfeksiyonun her aşamasını analiz etmek için adaptasyonlarla belirlenmiş bir enfeksiyon çokluğunda doku kültürü plakalarındaki kolon epitel hücrelerini enfekte etmek için standart bir protokolde kullanılır. Aderans testleri için, Shigella hücreleri, epitel hücreleriyle bakteriyel teması teşvik etmek için azaltılmış ortam seviyeleri ile inkübe edilir. Hem invazyon hem de hücre içi replikasyon deneyleri için, hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve invazyonun değerlendirilmesini ve / veya hücre içi replikasyon oranlarının ölçülmesini sağlamak için çeşitli zaman aralıklarında gentamisin uygulanır. Tüm enfeksiyon protokolleri, enfekte epitel hücre lizatlarını seri olarak seyrelterek ve Kongo kırmızı agar plakaları üzerindeki enfekte titrelere göre bakteri kolonisi oluşturan birimleri kaplayarak yapışık, istila edilmiş ve/veya hücre içi bakterileri numaralandırır. Birlikte, bu protokoller, bu patojeni başarılı bir şekilde incelemek için epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonunun her aşaması için bağımsız karakterizasyon ve karşılaştırmalar sağlar.

Diarrheal diseases caused by enteric bacterial pathogens are a significant global health burden. In 2016, diarrheal diseases were responsible for 1.3 million deaths worldwide and were the fourth leading cause of death in children younger than five years of age1,2. The Gram-negative, enteric bacterial pathogen Shigella is the causative agent of shigellosis, a major cause of diarrheal deaths worldwide3. Shigellosis causes significant morbidity and mortality each year in children from lower- and middle-income countries4,5, while infections in high-income countries are linked to daycare center, foodborne, and waterborne outbreaks6,7,8,9. Ineffective vaccine development10 and rising rates of antimicrobial resistance (AMR)11,12 have complicated the management of large-scale Shigella outbreaks. Recent Centers for Disease Control and Prevention data show that nearly 46% of Shigella infections in the United States displayed drug resistance in 202013,14, while the World Health Organization has declared Shigella as an AMR priority pathogen for which new therapies are urgently needed15.
Shigella infections are easily transmitted via the fecal-oral route upon ingestion of contaminated food or water, or through direct human contact. Shigella has evolved to be an efficient, human-adapted pathogen, with an infectious dose of 10-100 bacteria sufficient to cause disease16. During small intestinal transit, Shigella is exposed to environmental signals, such as elevated temperature and bile17. Detection of these signals induces transcriptional changes to express virulence factors that enhance the ability of the bacteria to infect the human colon17,18,19. Shigella does not invade the colonic epithelium from the apical surface, but rather transits across the epithelial layer following uptake into specialized antigen-presenting microfold cells (M cells) within the follicle-associated epithelium20,21,22. Following transcytosis, Shigella cells are phagocytosed by resident macrophages. Shigella rapidly escapes the phagosome and triggers macrophage cell death, resulting in the release of pro-inflammatory cytokines5,23,24. Shigella then invades colonic epithelial cells from the basolateral side, lyses the macropinocytic vacuole, and establishes a replicative niche in the cytoplasm5,25. Pro-inflammatory cytokines, particularly interleukin-8 (IL-8), recruit polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) to the site of infection, which weakens epithelial tight junctions, and enables bacterial infiltration of the epithelial lining to exacerbate basolateral infection5. The PMNs destroy the infected epithelial lining to contain the infection, which results in the characteristic symptoms of bacillary (bloody) dysentery5. Although invasion and intracellular replication mechanisms have been thoroughly characterized, new research is demonstrating important new concepts in Shigella infection, including virulence regulation during gastrointestinal (GI) transit17, adherence19, improved basolateral access through barrier permeability26, and asymptomatic carriage in malnourished children27.
The ability of Shigella spp. to cause diarrheal disease is restricted to humans and non-human primates (NHP)28. Shigella intestinal infection models have been developed for zebrafish29, mice30, guinea pigs31, rabbits21,32,33, and pigs34,35. However, none of these model systems can accurately replicate the disease characteristics observed during human infection36. Although NHP models of shigellosis have been established to study Shigella pathogenesis, these model systems are expensive to implement and require artificially high infectious doses, up to nine orders of magnitude higher than the infectious dose of humans37,38,39,40,41,42. Thus, the remarkable adaptation of Shigella for infection of human hosts necessitates the use of human-derived cell cultures to recreate physiologically relevant models for accurate interrogation of Shigella pathogenesis.
Here, detailed procedures are described to measure the rates of Shigella adherence to, invasion of, and replication within HT-29 colonic epithelial cells. Using these standardized protocols, the molecular mechanisms by which bacterial virulence genes and environmental signals impact each step of Shigella infection can be interrogated to better understand the dynamic host-pathogen interaction relationship.

Yazar Spotlight: Shigella Enfeksiyonlarını Anlama ve Mücadeledeki Gelişmeler

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Aderans, invazyon ve hücre içi replikasyon testleri, S. flexneri 2457T vahşi tip (WT) ile Shigella virülansını negatif olarak düzenlediği varsayılan bir mutant olan S. flexneri ΔVF (ΔVF) karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Shigella, virülansıdüzenlemek için bir sinyal olarak safra tuzlarını kullandığından 17,18,47, TSB ortamında bakteri alt kültüründen sonra deneyler yapıldı ve TSB% 0.4 (a / h) safra tuzları ile destekl...

Watch this Scientific Journal Video about Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella at JoVE.com

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella, her yıl yıkıcı enfeksiyon oranlarına neden olan önemli bir küresel patojendir. Shigella, ishal veya dizanteriye neden olmak için gastrointestinal sistemi enfekte eder. Araştırmamız, aşılar ve diğer antimikrobiyal ürünler gibi daha etkili terapötikler geliştirmeye yardımcı olmak için enfeksiyon anlayışımızı geliştirmeyi amaçlamaktadır.İlk olarak, hayvan modelleri ve ortaya çıkan doku kültürü teknikleri, Shigella enfeksiyonunun fizyolojisini daha iyi anlamamıza ve insan GI yolunun karmaşıklığını aslına uygun olarak yeniden üretmemize olanak tanır. İkincisi, klinik Shigella izolatlarının karakterizasyonu, bu cinsin çeşitliliğini yakalamaya, önemli virülans genlerini tanımlamaya ve enfeksiyon anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olmuştur. Shigella'nın ince bağırsakta geçişten nasıl kurtulduğunu ve kalın bağırsakta enfeksiyon için virülans gen ekspresyonunu nasıl düzenlediğini anlamak için safra tuzları ve glikoz gibi gastrointestinal sinyalleri kullandık.Shigella'nın safra tuzlarına nasıl direndiğini gösterdik ve Shigella'nın enfeksiyonu başlatmak için epitel hücreleriyle teması başlatmaya yardımcı olmak için yapışma proteinleri ürettiğini gösterdik. Bu protokoller, Shigella'nın aderansı, invazyonu ve hücre içi sağkalımı gibi epitelyal enfeksiyonun temel yönlerine bakmak için tasarlanmıştır. Bu protokolleri standart bir epitel hücre hattı kullanarak gerçekleştiriyoruz, ancak şu anda mevcut olan karmaşık insan GI modelleri için yöntemleri de uyarladık.Bu protokoller, enfeksiyonun her aşamasını bağımsız olarak ele alır, bu da Shigella enfeksiyonundaki temel adımları anlamak için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, kombine analizlerin Shigella enfeksiyonunun bütünsel düzeyde daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabileceğini vurgulamaktadırlar.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

628 Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Shigella, her yıl yıkıcı enfeksiyon oranlarına neden olan önemli bir küresel patojendir. Shigella, ishal veya dizanteriye neden olmak için gastrointestinal sistemi enfekte eder. Araştırmamız, aşılar ve diğer antimikrobiyal ürünler gibi daha etkili terapötikler geliştirmeye yardımcı olmak için enfeksiyon anlayışımızı geliştirmeyi amaçlamaktadır.İlk olarak, hayvan modelleri ve ortaya çıkan doku kültürü teknikleri, Shigella enfeksiyonunun fizyolojisini d...

Video: Yazar Spotlight: Shigella Enfeksiyonlarını Anlama ve Mücadeledeki Gelişmeler

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.