El apoyo a los autores incluye el Departamento de Pediatría del Hospital General de Massachusetts, el premio 2022A009041 del Comité Ejecutivo de Financiación de Apoyo Provisional a la Investigación (ISF), la subvención del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas R21AI146405 y la subvención del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales del Centro de Investigación de la Obesidad y la Nutrición de Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Protocolos para el análisis de la infección por Shigella en células epiteliales colónicas

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este protocolo describe un conjunto de tres ensayos estandarizados para estudiar la adherencia a Shigella, la invasión y la replicación intracelular de las células epiteliales intestinales. Aunque estos métodos no son más que versiones modificadas de los ensayos clásicos de gentamicina utilizados para estudiar la invasión y replicación intracelular de diversos patógenos bacterianos dentro de las células huésped 49,50,51, se deben aplicar consideraciones especiales cuando se estudia Shigella.<...

Las enfermedades diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos son una importante carga para la salud mundial. En 2016, las enfermedades diarreicas fueron responsables de 1,3 millones de muertes en todo el mundo y fueron la cuarta causa de muerte en niños menores de cinco años 1,2. El patógeno bacteriano entérico gramnegativo Shigella es el agente causal de la shigelosis, una de las principales causas de muerte diarreica en todo el mundo3. La shigelosis causa una morbilidad y mortalidad significativas cada año en niños de países de ingresos bajos y medianos 4,5, mientras que las infecciones en los países de ingresos altos están relacionadas con brotes de guarderías, transmitidos por los alimentos y por el agua 6,7,8,9. El desarrollo ineficaz de vacunas10 y el aumento de las tasas de resistencia a los antimicrobianos (RAM)11,12 han complicado el tratamiento de los brotes de Shigella a gran escala. Datos recientes de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades muestran que casi el 46% de las infecciones por Shigella en los Estados Unidos mostraron resistencia a los medicamentos en 202013,14, mientras que la Organización Mundial de la Salud ha declarado a Shigella como un patógeno prioritario de la resistencia a los antimicrobianos para el que se necesitan urgentemente nuevas terapias15.
Las infecciones por Shigella se transmiten fácilmente por vía fecal-oral tras la ingestión de alimentos o agua contaminados, o por contacto humano directo. Shigella ha evolucionado hasta convertirse en un patógeno eficiente y adaptado al ser humano, con una dosis infecciosa de 10-100 bacterias suficiente para causar la enfermedad16. Durante el tránsito del intestino delgado, Shigella está expuesta a señales ambientales, como temperatura elevada y bilis17. La detección de estas señales induce cambios transcripcionales para expresar factores de virulencia que potencian la capacidad de la bacteria para infectar el colon humano 17,18,19. Shigella no invade el epitelio colónico desde la superficie apical, sino que transita a través de la capa epitelial después de ser absorbida por células especializadas de micropliegues presentadores de antígenos (células M) dentro del epitelio asociado al folículo 20,21,22. Después de la transcitosis, las células de Shigella son fagocitadas por los macrófagos residentes. Shigella escapa rápidamente del fagosoma y desencadena la muerte celular de los macrófagos, lo que resulta en la liberación de citoquinas proinflamatorias 5,23,24. A continuación, Shigella invade las células epiteliales del colon desde el lado basolateral, lisa la vacuola macropinocítica y establece un nicho replicativo en el citoplasma 5,25. Las citocinas proinflamatorias, en particular la interleucina-8 (IL-8), reclutan leucocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) en el sitio de la infección, lo que debilita las uniones estrechas epiteliales y permite la infiltración bacteriana del revestimiento epitelial para exacerbar la infección basolateral5. Las PMN destruyen el revestimiento epitelial infectado para contener la infección, lo que da lugar a los síntomas característicos de la disentería bacilar (sanguinolenta)5. Aunque los mecanismos de invasión y replicación intracelular han sido ampliamente caracterizados, nuevas investigaciones están demostrando nuevos conceptos importantes en la infección por Shigella, incluyendo la regulación de la virulencia durante el tránsito gastrointestinal (GI)17, la adherencia19, la mejora del acceso basolateral a través de la permeabilidad de barrera26 y el porte asintomático en niños desnutridos27.
La capacidad de Shigella spp. para causar enfermedades diarreicas está restringida a humanos y primates no humanos (NHP)28. Se han desarrollado modelos de infección intestinal por Shigella para pez cebra29, ratones30, cobayas31, conejos 21,32,33 y cerdos34,35. Sin embargo, ninguno de estos sistemas modelo puede replicar con precisión las características de la enfermedad observadas durante la infección humana36. Aunque se han establecido modelos NHP de shigelosis para estudiar la patogénesis de Shigella, estos sistemas modelo son costosos de implementar y requieren dosis infecciosas artificialmente altas, hasta nueve órdenes de magnitud más altas que la dosis infecciosa de los humanos 37,38,39,40,41,42. Por lo tanto, la notable adaptación de Shigella para la infección de huéspedes humanos requiere el uso de cultivos celulares derivados de humanos para recrear modelos fisiológicamente relevantes para un interrogatorio preciso de la patogénesis de Shigella.
Aquí, se describen procedimientos detallados para medir las tasas de adherencia de Shigella , invasión y replicación dentro de las células epiteliales del colon HT-29. Utilizando estos protocolos estandarizados, se pueden interrogar los mecanismos moleculares por los cuales los genes de virulencia bacteriana y las señales ambientales afectan cada paso de la infección por Shigella para comprender mejor la relación dinámica de interacción huésped-patógeno.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PES filter</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td>17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>Plates are treated for optimal cell attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8756</td>
			<td>1:1 ratio of cholate to deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>A benzidine-based anionic diazo dye, &#62;85% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>To be used with the Countess Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A a highly polar organic reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat-inactivated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632</td>
			<td>Stock concentration is 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td>Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td>Laboratory sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1x concentration; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>30391023</td>
			<td>A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>A common non-ionic surfactant and emulsifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8907</td>
			<td>Bacterial growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epithelial cell infection analyses with shigella

Shigella, patógeno bacteriano entérico adaptado al ser humano, causa millones de infecciones cada año, crea efectos de crecimiento a largo plazo entre los pacientes pediátricos y es una de las principales causas de muertes diarreicas en todo el mundo. La infección induce diarrea acuosa o sanguinolenta como resultado de que el patógeno transita por el tracto gastrointestinal e infecta las células epiteliales que recubren el colon. Con el asombroso aumento de la resistencia a los antibióticos y la actual falta de vacunas aprobadas, los protocolos de investigación estandarizados son fundamentales para estudiar este formidable patógeno. Aquí, se presentan metodologías para examinar la patogénesis molecular de Shigella utilizando análisis in vitro de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular en células epiteliales del colon. Antes de los análisis de infección, el fenotipo de virulencia de las colonias de Shigella se verificó mediante la absorción del colorante rojo Congo en placas de agar. También se pueden considerar medios de laboratorio suplementados durante el cultivo bacteriano para imitar las condiciones in vivo. A continuación, las células bacterianas se utilizan en un protocolo estandarizado para infectar las células epiteliales del colon en placas de cultivo de tejidos en una multiplicidad establecida de infección con adaptaciones para analizar cada etapa de la infección. Para los ensayos de adherencia, las células de Shigella se incuban con niveles reducidos de medios para promover el contacto bacteriano con las células epiteliales. Tanto para los ensayos de invasión como para los de replicación intracelular, la gentamicina se aplica durante varios intervalos de tiempo para eliminar las bacterias extracelulares y permitir la evaluación de la invasión y/o la cuantificación de las tasas de replicación intracelular. Todos los protocolos de infección enumeran las bacterias adherentes, invadidas y/o intracelulares mediante la dilución en serie de lisados de células epiteliales infectadas y la siembra de unidades formadoras de colonias bacterianas en relación con los títulos de infección en placas de agar rojo Congo. En conjunto, estos protocolos permiten la caracterización independiente y las comparaciones para cada etapa de la infección por Shigella de las células epiteliales para estudiar este patógeno con éxito.

Diarrheal diseases caused by enteric bacterial pathogens are a significant global health burden. In 2016, diarrheal diseases were responsible for 1.3 million deaths worldwide and were the fourth leading cause of death in children younger than five years of age1,2. The Gram-negative, enteric bacterial pathogen Shigella is the causative agent of shigellosis, a major cause of diarrheal deaths worldwide3. Shigellosis causes significant morbidity and mortality each year in children from lower- and middle-income countries4,5, while infections in high-income countries are linked to daycare center, foodborne, and waterborne outbreaks6,7,8,9. Ineffective vaccine development10 and rising rates of antimicrobial resistance (AMR)11,12 have complicated the management of large-scale Shigella outbreaks. Recent Centers for Disease Control and Prevention data show that nearly 46% of Shigella infections in the United States displayed drug resistance in 202013,14, while the World Health Organization has declared Shigella as an AMR priority pathogen for which new therapies are urgently needed15.
Shigella infections are easily transmitted via the fecal-oral route upon ingestion of contaminated food or water, or through direct human contact. Shigella has evolved to be an efficient, human-adapted pathogen, with an infectious dose of 10-100 bacteria sufficient to cause disease16. During small intestinal transit, Shigella is exposed to environmental signals, such as elevated temperature and bile17. Detection of these signals induces transcriptional changes to express virulence factors that enhance the ability of the bacteria to infect the human colon17,18,19. Shigella does not invade the colonic epithelium from the apical surface, but rather transits across the epithelial layer following uptake into specialized antigen-presenting microfold cells (M cells) within the follicle-associated epithelium20,21,22. Following transcytosis, Shigella cells are phagocytosed by resident macrophages. Shigella rapidly escapes the phagosome and triggers macrophage cell death, resulting in the release of pro-inflammatory cytokines5,23,24. Shigella then invades colonic epithelial cells from the basolateral side, lyses the macropinocytic vacuole, and establishes a replicative niche in the cytoplasm5,25. Pro-inflammatory cytokines, particularly interleukin-8 (IL-8), recruit polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) to the site of infection, which weakens epithelial tight junctions, and enables bacterial infiltration of the epithelial lining to exacerbate basolateral infection5. The PMNs destroy the infected epithelial lining to contain the infection, which results in the characteristic symptoms of bacillary (bloody) dysentery5. Although invasion and intracellular replication mechanisms have been thoroughly characterized, new research is demonstrating important new concepts in Shigella infection, including virulence regulation during gastrointestinal (GI) transit17, adherence19, improved basolateral access through barrier permeability26, and asymptomatic carriage in malnourished children27.
The ability of Shigella spp. to cause diarrheal disease is restricted to humans and non-human primates (NHP)28. Shigella intestinal infection models have been developed for zebrafish29, mice30, guinea pigs31, rabbits21,32,33, and pigs34,35. However, none of these model systems can accurately replicate the disease characteristics observed during human infection36. Although NHP models of shigellosis have been established to study Shigella pathogenesis, these model systems are expensive to implement and require artificially high infectious doses, up to nine orders of magnitude higher than the infectious dose of humans37,38,39,40,41,42. Thus, the remarkable adaptation of Shigella for infection of human hosts necessitates the use of human-derived cell cultures to recreate physiologically relevant models for accurate interrogation of Shigella pathogenesis.
Here, detailed procedures are described to measure the rates of Shigella adherence to, invasion of, and replication within HT-29 colonic epithelial cells. Using these standardized protocols, the molecular mechanisms by which bacterial virulence genes and environmental signals impact each step of Shigella infection can be interrogated to better understand the dynamic host-pathogen interaction relationship.

Autor destacado: Avances en la comprensión y el combate de las infecciones por Shigella

Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

Shigella is a significant global pathogen that causes devastating infection rates every year. Shigella infects the gastrointestinal tract to cause diarrhea or dysentery. Our research aims to improve our understanding of infection to help develop more effective therapeutics like vaccines and other antimicrobial products.First, animal models and emerging tissue culture techniques allow us to better understand the physiology of Shigella infection and faithfully reproduce the complexity of the human GI tract. Second, characterization of clinical Shigella isolates has helped to capture the diversity of this genus, identify important virulence genes, and improve our understanding of infection. We have used gastrointestinal signals like bile salts and glucose to understand how Shigella survives transit in the small intestine and regulates virulence gene expression for infection in the large intestine.We have demonstrated how Shigella resists bile salts and have shown that Shigella produces adherence proteins to help initiate contact with epithelial cells to start infection. These protocols are designed to look at key aspects of epithelial infection like adherence, invasion, and intracellular survival of Shigella. We are performing these protocols using a standard epithelial cell line, but have also adapted the methods for sophisticated human GI models that are now available.These protocols consider each phase of infection independently, which is critical to understand the key steps in Shigella infection. They also highlight that combined analyses can facilitate a greater understanding of Shigella infection at a holistic level.

Se realizaron ensayos de adherencia, invasión y replicación intracelular comparando el tipo salvaje (WT) de S. flexneri 2457T con el ΔVF (ΔVF) de S. flexneri, un mutante que se supone que regula negativamente la virulencia de Shigella. Dado que Shigella utiliza sales biliares como señal para regular la virulencia 17,18,47, los experimentos se realizaron después de un subcultivo bacteriano en medios TSB, así como TSB suplementada con sales biliares al 0,4% (p/v)<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella at JoVE.com

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

La Shigella es un importante patógeno mundial que causa tasas de infección devastadoras cada año. La Shigella infecta el tracto gastrointestinal y causa diarrea o disentería. Nuestra investigación tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la infección para ayudar a desarrollar terapias más efectivas, como vacunas y otros productos antimicrobianos.En primer lugar, los modelos animales y las técnicas emergentes de cultivo de tejidos nos permiten comprender mejor la fisiología de la infección por Shigella y reproducir fielmente la complejidad del tracto gastrointestinal humano. En segundo lugar, la caracterización de los aislados clínicos de Shigella ha ayudado a capturar la diversidad de este género, identificar genes de virulencia importantes y mejorar nuestra comprensión de la infección. Hemos utilizado señales gastrointestinales como las sales biliares y la glucosa para comprender cómo la Shigella sobrevive al tránsito en el intestino delgado y regula la expresión génica de la virulencia para la infección en el intestino grueso.Hemos demostrado cómo la Shigella resiste a las sales biliares y hemos demostrado que la Shigella produce proteínas de adherencia para ayudar a iniciar el contacto con las células epiteliales para iniciar la infección. Estos protocolos están diseñados para analizar aspectos clave de la infección epitelial, como la adherencia, la invasión y la supervivencia intracelular de Shigella. Estamos realizando estos protocolos utilizando una línea celular epitelial estándar, pero también hemos adaptado los métodos para modelos gastrointestinales humanos sofisticados que ahora están disponibles.Estos protocolos consideran cada fase de la infección de forma independiente, lo cual es fundamental para comprender los pasos clave en la infección por Shigella. También destacan que los análisis combinados pueden facilitar una mayor comprensión de la infección por Shigella a nivel holístico.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

563 vistas.  Massachusetts General Hospital. La Shigella es un importante patógeno mundial que causa tasas de infección devastadoras cada año. La Shigella infecta el tracto gastrointestinal y causa diarrea o disentería. Nuestra investigación tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la infección para ayudar a desarrollar terapias más efectivas, como vacunas y otros productos antimicrobianos.En primer lugar, los modelos animales y las técnicas emergentes de cultivo de tejidos nos permiten comprender mejor la fisi...

Video: Autor destacado: Avances en la comprensión y el combate de las infecciones por Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.