저자에 대한 지원에는 매사추세츠 종합병원 소아과, 연구 중간 지원 기금 집행 위원회(ISF) 상 2022A009041, 국립 알레르기 및 전염병 연구소 보조금 R21AI146405, 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 하버드 영양 비만 연구 센터(NORCH) 2P30DK040561-26이 포함됩니다. 연구비 지원자들은 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 출판 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다.

결장 상피세포의 Shigella 감염을 분석하기 위한 프로토콜

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 장 상피 세포의 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 연구하기 위한 세 가지 표준화된 분석 세트를 설명합니다. 이러한 방법은 숙주 세포 내에서 다양한 박테리아 병원체의 침입 및 세포 내 복제를 연구하는 데 사용되는 고전적인 겐타마이신 분석법의 수정된 버전일 뿐이지만(49,50,51), Shigella를 연구...

장내 세균성 병원체로 인한 설사병은 전 세계적으로 심각한 건강 부담입니다. 2016년 설사병은 전 세계적으로 130만 명의 사망을 초래했으며 1,2세 미만 5세 미만 어린이의 사망 원인 중 4위를 차지했습니다. 그람 음성, 장 세균성 병원균 Shigella는 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인인 이질증의 원인균입니다3. 이질균은 저소득 및 중간소득 국가의 아동에서 매년 상당한 이환율과 사망률을 유발하며4,5 고소득 국가의 감염은 탁아소, 식품 매개 및 수인성 발병과 관련이 있습니다6,7,8,9. 비효율적인 백신 개발10 및 항생제 내성(AMR)11,12 증가로 인해 대규모 이질균 발병 관리가 복잡해졌습니다. 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)의 최근 자료에 따르면 2020년 미국 내 이질균 감염의 약 46%가 약물 내성을 보였으며13,14 세계보건기구(WHO)는 시겔라를 새로운 치료법이 시급히 필요한 항생제 내성 우선 병원체로 선언했다15.
이질균 감염은 오염된 음식이나 물을 섭취할 때 분변-경구 경로를 통해 또는 직접적인 인체 접촉을 통해 쉽게 전염됩니다. Shigella는 질병을 일으키기에 충분한 10-100개의 박테리아를 가진 효율적이고 인간에 적응한 병원체로 진화했습니다16. 소장 이동 중에 Shigella는 체온 상승 및 담즙과 같은 환경 신호에 노출됩니다17. 이러한 신호의 검출은 인간 결장을 감염시키는 박테리아의 능력을 향상시키는 독성 인자를 발현하기 위해 전사 변화를 유도합니다 17,18,19. Shigella는 정점 표면에서 결장 상피를 침범하지 않고 오히려 소낭 관련 상피20,21,22 내의 특수 항원 제시 마이크로 폴드 세포 (M 세포)로 흡수 된 후 상피 층을 가로 질러 이동합니다. transcytosis에 이어, Shigella 세포는 상주 대식세포에 의해 phagocytosed됩니다. Shigella는 식체를 빠르게 탈출하고 대식세포 세포 사멸을 유발하여 전염증성 사이토카인 5,23,24를 방출합니다. 그런 다음 Shigella는 기저측에서 결장 상피 세포에 침입하여 macropinocytic 액포를 용해시키고 세포질 5,25에 복제 틈새를 설정합니다. 전염증성 사이토카인, 특히 인터루킨-8(IL-8)은 다형핵 호중구 백혈구(PMN)를 감염 부위에 모집하여 상피의 단단한 접합부를 약화시키고 상피 내벽의 박테리아 침투를 가능하게 하여 기저외측 감염을 악화시킨다5. PMN은 감염된 상피 내벽을 파괴하여 감염을 억제하며, 이는 세균성(혈성) 이질의 특징적인 증상을 초래한다5. 침습 및 세포 내 복제 메커니즘이 철저하게 규명되었지만, 새로운 연구는 위장관 (GI) 통과 중 독성 조절17, 순응19, 장벽 투과성을 통한 기저측 접근 개선26 및 영양실조 아동27의 무증상 보균을 포함하여 이질균 감염에 대한 중요한 새로운 개념을 입증하고 있습니다.
설사병을 유발하는 Shigella spp.의 능력은 인간과 비인간 영장류(NHP)로 제한됩니다(NHP)28. Shigella 장 감염 모델은 제브라피시29, 마우스30, 기니피그31, 토끼 21,32,33 및 돼지34,35에 대해 개발되었습니다. 그러나, 이들 모델 시스템 중 어느 것도 인간 감염 중에 관찰된 질병 특성을 정확하게 복제할 수 없다36. 이질균의 NHP 모델은 이질균 발병 기전을 연구하기 위해 확립되었지만, 이러한 모델 시스템은 구현하는 데 비용이 많이 들고 인간의 감염 선량보다 최대 9배나 높은 인위적으로 높은 감염 선량을 필요로 합니다 37,38,39,40,41,42. 따라서 인간 숙주의 감염에 대한 Shigella의 놀라운 적응은 Shigella 발병 기전의 정확한 조사를 위해 생리학적으로 관련된 모델을 재현하기 위해 인간 유래 세포 배양을 사용해야 합니다.
여기에서는 HT-29 결장 상피 세포 내에서 Shigella 부착률, 침습 및 복제율을 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 표준화된 프로토콜을 사용하여 박테리아 독성 유전자와 환경 신호가 Shigella 감염의 각 단계에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 조사하여 동적 숙주-병원체 상호 작용 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PES filter</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td>17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>Plates are treated for optimal cell attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8756</td>
			<td>1:1 ratio of cholate to deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>A benzidine-based anionic diazo dye, &#62;85% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>To be used with the Countess Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A a highly polar organic reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat-inactivated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632</td>
			<td>Stock concentration is 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td>Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td>Laboratory sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1x concentration; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>30391023</td>
			<td>A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>A common non-ionic surfactant and emulsifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8907</td>
			<td>Bacterial growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epithelial cell infection analyses with shigella

인간이 적응한 장내 세균 병원균 Shigella는 매년 수백만 건의 감염을 일으키고, 소아 환자들 사이에서 장기적인 성장 효과를 일으키며, 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인입니다. 감염은 병원체가 위장관을 통과하여 결장 내벽의 상피 세포를 감염시킨 결과로 물이나 피가 섞인 설사를 유발합니다. 항생제 내성이 급격히 증가하고 현재 승인된 백신이 부족하기 때문에 이 무시무시한 병원체를 연구하기 위해서는 표준화된 연구 프로토콜이 매우 중요합니다. 여기에서는 결장 상피 세포에서 박테리아 부착, 침습 및 세포 내 복제에 대한 시험관 내 분석을 사용하여 Shigella의 분자 발병 기전을 조사하는 방법론을 제시합니다. 감염 분석 이전에, Shigella 군집의 독성 표현형은 한천 플레이트에서 콩고 적색 염료의 흡수에 의해 확인되었습니다. 보충된 실험실 배지는 in vivo 조건을 모방하기 위해 박테리아 배양 중에 고려할 수도 있습니다. 그런 다음 박테리아 세포는 표준화된 프로토콜에서 조직 배양 플레이트의 결장 상피 세포를 확립된 다중성 감염에서 감염시키고 각 감염 단계를 분석하기 위한 적응을 통해 사용합니다. 부착 분석의 경우, Shigella 세포는 상피 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하기 위해 감소된 배지 수준으로 배양됩니다. 침습 및 세포 내 복제 분석 모두에서 겐타마이신은 세포 외 박테리아를 제거하고 침입 평가 및/또는 세포 내 복제 속도의 정량화를 가능하게 하기 위해 다양한 시간 간격으로 적용됩니다. 모든 감염 프로토콜은 감염된 상피 세포 용해물을 연속적으로 희석하고 콩고 적색 한천 플레이트의 감염 역가와 관련된 박테리아 콜로니 형성 단위를 도금하여 부착, 침입 및/또는 세포 내 박테리아를 열거합니다. 이러한 프로토콜은 상피 세포의 이질균 감염의 각 단계에 대한 독립적인 특성 분석 및 비교를 통해 이 병원체를 성공적으로 연구할 수 있습니다.

Diarrheal diseases caused by enteric bacterial pathogens are a significant global health burden. In 2016, diarrheal diseases were responsible for 1.3 million deaths worldwide and were the fourth leading cause of death in children younger than five years of age1,2. The Gram-negative, enteric bacterial pathogen Shigella is the causative agent of shigellosis, a major cause of diarrheal deaths worldwide3. Shigellosis causes significant morbidity and mortality each year in children from lower- and middle-income countries4,5, while infections in high-income countries are linked to daycare center, foodborne, and waterborne outbreaks6,7,8,9. Ineffective vaccine development10 and rising rates of antimicrobial resistance (AMR)11,12 have complicated the management of large-scale Shigella outbreaks. Recent Centers for Disease Control and Prevention data show that nearly 46% of Shigella infections in the United States displayed drug resistance in 202013,14, while the World Health Organization has declared Shigella as an AMR priority pathogen for which new therapies are urgently needed15.
Shigella infections are easily transmitted via the fecal-oral route upon ingestion of contaminated food or water, or through direct human contact. Shigella has evolved to be an efficient, human-adapted pathogen, with an infectious dose of 10-100 bacteria sufficient to cause disease16. During small intestinal transit, Shigella is exposed to environmental signals, such as elevated temperature and bile17. Detection of these signals induces transcriptional changes to express virulence factors that enhance the ability of the bacteria to infect the human colon17,18,19. Shigella does not invade the colonic epithelium from the apical surface, but rather transits across the epithelial layer following uptake into specialized antigen-presenting microfold cells (M cells) within the follicle-associated epithelium20,21,22. Following transcytosis, Shigella cells are phagocytosed by resident macrophages. Shigella rapidly escapes the phagosome and triggers macrophage cell death, resulting in the release of pro-inflammatory cytokines5,23,24. Shigella then invades colonic epithelial cells from the basolateral side, lyses the macropinocytic vacuole, and establishes a replicative niche in the cytoplasm5,25. Pro-inflammatory cytokines, particularly interleukin-8 (IL-8), recruit polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) to the site of infection, which weakens epithelial tight junctions, and enables bacterial infiltration of the epithelial lining to exacerbate basolateral infection5. The PMNs destroy the infected epithelial lining to contain the infection, which results in the characteristic symptoms of bacillary (bloody) dysentery5. Although invasion and intracellular replication mechanisms have been thoroughly characterized, new research is demonstrating important new concepts in Shigella infection, including virulence regulation during gastrointestinal (GI) transit17, adherence19, improved basolateral access through barrier permeability26, and asymptomatic carriage in malnourished children27.
The ability of Shigella spp. to cause diarrheal disease is restricted to humans and non-human primates (NHP)28. Shigella intestinal infection models have been developed for zebrafish29, mice30, guinea pigs31, rabbits21,32,33, and pigs34,35. However, none of these model systems can accurately replicate the disease characteristics observed during human infection36. Although NHP models of shigellosis have been established to study Shigella pathogenesis, these model systems are expensive to implement and require artificially high infectious doses, up to nine orders of magnitude higher than the infectious dose of humans37,38,39,40,41,42. Thus, the remarkable adaptation of Shigella for infection of human hosts necessitates the use of human-derived cell cultures to recreate physiologically relevant models for accurate interrogation of Shigella pathogenesis.
Here, detailed procedures are described to measure the rates of Shigella adherence to, invasion of, and replication within HT-29 colonic epithelial cells. Using these standardized protocols, the molecular mechanisms by which bacterial virulence genes and environmental signals impact each step of Shigella infection can be interrogated to better understand the dynamic host-pathogen interaction relationship.

저자 스포트라이트: Shigella 감염에 대한 이해 및 퇴치의 발전

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Shigella is a significant global pathogen that causes devastating infection rates every year. Shigella infects the gastrointestinal tract to cause diarrhea or dysentery. Our research aims to improve our understanding of infection to help develop more effective therapeutics like vaccines and other antimicrobial products.First, animal models and emerging tissue culture techniques allow us to better understand the physiology of Shigella infection and faithfully reproduce the complexity of the human GI tract. Second, characterization of clinical Shigella isolates has helped to capture the diversity of this genus, identify important virulence genes, and improve our understanding of infection. We have used gastrointestinal signals like bile salts and glucose to understand how Shigella survives transit in the small intestine and regulates virulence gene expression for infection in the large intestine.We have demonstrated how Shigella resists bile salts and have shown that Shigella produces adherence proteins to help initiate contact with epithelial cells to start infection. These protocols are designed to look at key aspects of epithelial infection like adherence, invasion, and intracellular survival of Shigella. We are performing these protocols using a standard epithelial cell line, but have also adapted the methods for sophisticated human GI models that are now available.These protocols consider each phase of infection independently, which is critical to understand the key steps in Shigella infection. They also highlight that combined analyses can facilitate a greater understanding of Shigella infection at a holistic level.

S. flexneri 2457T 야생형(WT)과 Shigella 독성을 부정적으로 조절하는 것으로 가정된 돌연변이인 S. flexneri ΔVF(ΔVF)를 비교하여 부착, 침습 및 세포 내 복제 분석을 수행했습니다. Shigella는 독성을 조절하기 위한 신호로 담즙염을 사용하기 때문에(17,18,47), TSB 배지 및 0.4%(w/v) 담즙염이 보충된 TSB에서 박테리아 부배양 후 실험을 수행하였다<sup class="...

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본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella는 매년 치명적인 감염률을 유발하는 중요한 글로벌 병원체입니다. Shigella는 위장관을 감염시켜 설사나 이질을 일으킵니다. 우리의 연구는 백신 및 기타 항균 제품과 같은 보다 효과적인 치료법을 개발하는 데 도움이 되도록 감염에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다.첫째, 동물 모델과 새로운 조직 배양 기술을 통해 Shigella 감염의 생리학을 더 잘 이해하고 인간 위장관의 복잡성을 충실하게 재현할 수 있습니다. 둘째, 임상 Shigella 분리물의 특성 분석은 이 속의 다양성을 포착하고, 중요한 독성 유전자를 식별하고, 감염에 대한 이해를 개선하는 데 도움이 되었습니다. 우리는 담즙염 및 포도당과 같은 위장관 신호를 사용하여 Shigella가 소장에서 어떻게 생존하고 대장 감염에 대한 독성 유전자 발현을 조절하는지 이해했습니다.우리는 Shigella가 담즙염에 저항하는 방법을 보여주었고 Shigella가 상피 세포와의 접촉을 시작하여 감염을 시작하는 데 도움이 되는 부착 단백질을 생성한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 Shigella의 부착, 침습 및 세포 내 생존과 같은 상피 감염의 주요 측면을 살펴보도록 설계되었습니다. 당사는 표준 상피 세포주를 사용하여 이러한 프로토콜을 수행하고 있지만, 현재 사용 가능한 정교한 인간 GI 모델에 대한 방법도 적용했습니다.이러한 프로토콜은 감염의 각 단계를 독립적으로 고려하며, 이는 Shigella 감염의 주요 단계를 이해하는 데 중요합니다. 또한 통합 분석을 통해 전체론적 수준에서 Shigella 감염에 대한 이해를 높일 수 있음을 강조합니다.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

582 조회수.  Massachusetts General Hospital. Shigella는 매년 치명적인 감염률을 유발하는 중요한 글로벌 병원체입니다. Shigella는 위장관을 감염시켜 설사나 이질을 일으킵니다. 우리의 연구는 백신 및 기타 항균 제품과 같은 보다 효과적인 치료법을 개발하는 데 도움이 되도록 감염에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다.첫째, 동물 모델과 새로운 조직 배양 기술을 통해 Shigella 감염의 생리학을 더 잘 이해하고 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: Shigella 감염에 대한 이해 및 퇴치의 발전

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.