O apoio aos autores inclui o Departamento de Pediatria do Hospital Geral de Massachusetts, o prêmio 2022A009041 do Comitê Executivo de Financiamento de Apoio Provisório à Pesquisa (ISF), o R21AI146405 de concessão do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais concedem o Centro de Pesquisa em Obesidade Nutricional em Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Protocolos para análise da infecção por Shigella em células epiteliais do cólon

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este protocolo descreve um conjunto de três ensaios padronizados para estudar a adesão, invasão e replicação intracelular de células epiteliais intestinais por Shigella. Embora esses métodos sejam apenas versões modificadas dos ensaios clássicos de gentamicina usados para estudar a invasão e replicação intracelular de vários patógenos bacterianos dentro das células hospedeiras 49,50,51, considerações especiais devem ser aplicadas no estudo</su...

As doenças diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos são um importante fardo global para a saúde. Em 2016, as doenças diarreicas foram responsáveis por 1,3 milhão de mortes no mundo e foram a quarta causa de morte em crianças menores de cinco anos 1,2. O patógeno bacteriano entérico Gram-negativo Shigella é o agente causador da shiguelose, uma das principais causas de mortes diarreicas no mundo3. A shigelose causa morbidade e mortalidade significativas a cada ano em crianças de países de baixa e média renda 4,5, enquanto infecções em países de alta renda estão ligadas a surtos de creches, alimentos e água 6,7,8,9. O desenvolvimento ineficaz devacinas10 e o aumento das taxas de resistência antimicrobiana (RAM)11,12 têm dificultado o manejo de surtos de Shigella em larga escala. Dados recentes do Centers for Disease Control and Prevention mostram que quase 46% das infecções por Shigella nos Estados Unidos apresentaram resistência aos medicamentos em 202013,14, enquanto a Organização Mundial da Saúde declarou a Shigella como um patógeno prioritário para a RAM, para o qual novas terapias são urgentemente necessárias15.
As infecções por Shigella são facilmente transmitidas pela via fecal-oral após a ingestão de água ou alimentos contaminados, ou através do contato humano direto. Shigella evoluiu para ser um patógeno eficiente, adaptado ao homem, com uma dose infecciosa de 10-100 bactérias suficiente para causar doença16. Durante o trânsito do intestino delgado, Shigella é exposta a sinais ambientais, como temperatura elevada e bile17. A detecção desses sinais induz alterações transcricionais para expressar fatores de virulência que aumentam a capacidade da bactéria de infectar o cólon humano 17,18,19. Shigella não invade o epitélio colônico a partir da superfície apical, mas transita através da camada epitelial após captação em células especializadas de microdobras apresentadoras de antígenos (células M) dentro do epitélio associado ao folículo 20,21,22. Após a transcitose, as células de Shigella são fagocitadas por macrófagos residentes. Shigella escapa rapidamente do fagossomo e desencadeia a morte celular de macrófagos, resultando na liberação de citocinas pró-inflamatórias 5,23,24. Shigella então invade células epiteliais colônicas do lado basolateral, lisa o vacúolo macropinocítico e estabelece um nicho replicativo no citoplasma 5,25. As citocinas pró-inflamatórias, particularmente a interleucina-8 (IL-8), recrutam leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) para o local da infecção, o que enfraquece as tight junctions epiteliais e permite a infiltração bacteriana do revestimento epitelial para exacerbar a infecção basolateral5. Os PMNs destroem o revestimento epitelial infectado para conter a infecção, o que resulta nos sintomas característicos da disenteria bacilar (sangrenta)5. Embora os mecanismos de invasão e replicação intracelular tenham sido completamente caracterizados, novas pesquisas estão demonstrando novos conceitos importantes na infecção por Shigella, incluindo regulação da virulência durante o trânsito gastrointestinal (GI)17, adesão19, melhor acesso basolateral através da permeabilidade da barreira26 e carreamento assintomático em crianças desnutridas27.
A capacidade de Shigella spp causar doença diarreica é restrita a humanos e primatas não humanos (PNH)28. Modelos de infecção intestinal por Shigella foram desenvolvidos para zebrafish29, camundongos30, cobaias31, coelhos 21,32,33 e suínos34,35. No entanto, nenhum desses sistemas-modelo pode replicar com precisão as características da doença observadas durante a infecção humana36. Embora modelos de shigelose do NHP tenham sido estabelecidos para estudar a patogênese da Shigella, esses sistemas modelo são caros de implementar e requerem doses infecciosas artificialmente altas, até nove ordens de magnitude superiores à dose infecciosa em humanos 37,38,39,40,41,42. Assim, a notável adaptação de Shigella para infecção de hospedeiros humanos requer o uso de culturas de células derivadas de humanos para recriar modelos fisiologicamente relevantes para interrogação precisa da patogênese de Shigella.
Aqui, procedimentos detalhados são descritos para medir as taxas de aderência, invasão e replicação de Shigella dentro de células epiteliais colônicas HT-29. Usando esses protocolos padronizados, os mecanismos moleculares pelos quais os genes de virulência bacteriana e os sinais ambientais impactam cada etapa da infecção por Shigella podem ser interrogados para melhor entender a relação dinâmica de interação patógeno-hospedeiro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PES filter</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td>17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>Plates are treated for optimal cell attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8756</td>
			<td>1:1 ratio of cholate to deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>A benzidine-based anionic diazo dye, &#62;85% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>To be used with the Countess Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A a highly polar organic reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat-inactivated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632</td>
			<td>Stock concentration is 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td>Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td>Laboratory sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1x concentration; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>30391023</td>
			<td>A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>A common non-ionic surfactant and emulsifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8907</td>
			<td>Bacterial growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epithelial cell infection analyses with shigella

O patógeno bacteriano entérico adaptado ao ser humano Shigella causa milhões de infecções a cada ano, cria efeitos de crescimento a longo prazo entre pacientes pediátricos e é uma das principais causas de mortes diarreicas em todo o mundo. A infecção induz diarreia aquosa ou sanguinolenta como resultado do patógeno transitar pelo trato gastrointestinal e infectar as células epiteliais que revestem o cólon. Com aumentos impressionantes na resistência aos antibióticos e a atual falta de vacinas aprovadas, protocolos de pesquisa padronizados são críticos para estudar esse formidável patógeno. Aqui, metodologias são apresentadas para examinar a patogênese molecular de Shigella usando análises in vitro de adesão, invasão e replicação intracelular bacteriana em células epiteliais colônicas. Antes das análises da infecção, o fenótipo de virulência das colônias de Shigella foi verificado pela absorção do corante vermelho Congo em placas de ágar. Meios laboratoriais suplementados também podem ser considerados durante a cultura bacteriana para mimetizar condições in vivo . As células bacterianas são então utilizadas em um protocolo padronizado para infectar células epiteliais colônicas em placas de cultura de tecidos em uma multiplicidade estabelecida de infecção com adaptações para analisar cada estágio da infecção. Para os ensaios de aderência, as células de Shigella são incubadas com níveis reduzidos de meios para promover o contato bacteriano com as células epiteliais. Tanto para ensaios de invasão quanto para replicação intracelular, a gentamicina é aplicada por vários intervalos de tempo para eliminar bactérias extracelulares e permitir a avaliação da invasão e/ou a quantificação das taxas de replicação intracelular. Todos os protocolos de infecção enumeram bactérias aderentes, invadidas e/ou intracelulares diluindo em série lisados de células epiteliais infectadas e plaqueando unidades formadoras de colônias bacterianas em relação aos títulos infectantes em placas de ágar vermelho Congo. Em conjunto, esses protocolos permitem caracterizar e comparar de forma independente cada estágio da infecção por Shigella em células epiteliais para estudar este patógeno com sucesso.

Diarrheal diseases caused by enteric bacterial pathogens are a significant global health burden. In 2016, diarrheal diseases were responsible for 1.3 million deaths worldwide and were the fourth leading cause of death in children younger than five years of age1,2. The Gram-negative, enteric bacterial pathogen Shigella is the causative agent of shigellosis, a major cause of diarrheal deaths worldwide3. Shigellosis causes significant morbidity and mortality each year in children from lower- and middle-income countries4,5, while infections in high-income countries are linked to daycare center, foodborne, and waterborne outbreaks6,7,8,9. Ineffective vaccine development10 and rising rates of antimicrobial resistance (AMR)11,12 have complicated the management of large-scale Shigella outbreaks. Recent Centers for Disease Control and Prevention data show that nearly 46% of Shigella infections in the United States displayed drug resistance in 202013,14, while the World Health Organization has declared Shigella as an AMR priority pathogen for which new therapies are urgently needed15.
Shigella infections are easily transmitted via the fecal-oral route upon ingestion of contaminated food or water, or through direct human contact. Shigella has evolved to be an efficient, human-adapted pathogen, with an infectious dose of 10-100 bacteria sufficient to cause disease16. During small intestinal transit, Shigella is exposed to environmental signals, such as elevated temperature and bile17. Detection of these signals induces transcriptional changes to express virulence factors that enhance the ability of the bacteria to infect the human colon17,18,19. Shigella does not invade the colonic epithelium from the apical surface, but rather transits across the epithelial layer following uptake into specialized antigen-presenting microfold cells (M cells) within the follicle-associated epithelium20,21,22. Following transcytosis, Shigella cells are phagocytosed by resident macrophages. Shigella rapidly escapes the phagosome and triggers macrophage cell death, resulting in the release of pro-inflammatory cytokines5,23,24. Shigella then invades colonic epithelial cells from the basolateral side, lyses the macropinocytic vacuole, and establishes a replicative niche in the cytoplasm5,25. Pro-inflammatory cytokines, particularly interleukin-8 (IL-8), recruit polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) to the site of infection, which weakens epithelial tight junctions, and enables bacterial infiltration of the epithelial lining to exacerbate basolateral infection5. The PMNs destroy the infected epithelial lining to contain the infection, which results in the characteristic symptoms of bacillary (bloody) dysentery5. Although invasion and intracellular replication mechanisms have been thoroughly characterized, new research is demonstrating important new concepts in Shigella infection, including virulence regulation during gastrointestinal (GI) transit17, adherence19, improved basolateral access through barrier permeability26, and asymptomatic carriage in malnourished children27.
The ability of Shigella spp. to cause diarrheal disease is restricted to humans and non-human primates (NHP)28. Shigella intestinal infection models have been developed for zebrafish29, mice30, guinea pigs31, rabbits21,32,33, and pigs34,35. However, none of these model systems can accurately replicate the disease characteristics observed during human infection36. Although NHP models of shigellosis have been established to study Shigella pathogenesis, these model systems are expensive to implement and require artificially high infectious doses, up to nine orders of magnitude higher than the infectious dose of humans37,38,39,40,41,42. Thus, the remarkable adaptation of Shigella for infection of human hosts necessitates the use of human-derived cell cultures to recreate physiologically relevant models for accurate interrogation of Shigella pathogenesis.
Here, detailed procedures are described to measure the rates of Shigella adherence to, invasion of, and replication within HT-29 colonic epithelial cells. Using these standardized protocols, the molecular mechanisms by which bacterial virulence genes and environmental signals impact each step of Shigella infection can be interrogated to better understand the dynamic host-pathogen interaction relationship.

Autor em destaque: Avanços na compreensão e combate às infecções por Shigella

Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Ensaios de aderência, invasão e replicação intracelular foram realizados comparando S. flexneri 2457T wild type (WT) com S. flexneri ΔVF (ΔVF), um mutante hipotetizado para regular negativamente a virulência de Shigella. Como Shigella utiliza sais biliares como sinal para regular a virulência 17,18,47, experimentos foram realizados após subcultivo bacteriano em meio TSB e TSB suplementado com sais biliares a 0,4% (p/v) <sup class="xr...

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O presente protocolo descreve ensaios de infecção para interrogar a adesão, invasão e replicação intracelular de Shigella usando linhagens celulares epiteliais in vitro .

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella é um patógeno global significativo que causa taxas de infecção devastadoras a cada ano. Shigella infecta o trato gastrointestinal para causar diarreia ou disenteria. Nossa pesquisa visa melhorar nossa compreensão da infecção para ajudar a desenvolver terapêuticas mais eficazes, como vacinas e outros produtos antimicrobianos.Primeiro, modelos animais e técnicas emergentes de cultura de tecidos nos permitem entender melhor a fisiologia da infecção por Shigella e reproduzir fielmente a complexidade do trato gastrointestinal humano. Em segundo lugar, a caracterização de isolados clínicos de Shigella ajudou a capturar a diversidade desse gênero, identificar genes de virulência importantes e melhorar nossa compreensão da infecção. Usamos sinais gastrointestinais como sais biliares e glicose para entender como Shigella sobrevive ao trânsito no intestino delgado e regula a expressão gênica de virulência para infecção no intestino grosso.Nós demonstramos como Shigella resiste aos sais biliares e mostramos que Shigella produz proteínas de aderência para ajudar a iniciar o contato com as células epiteliais para iniciar a infecção. Esses protocolos são projetados para analisar aspectos-chave da infecção epitelial, como adesão, invasão e sobrevivência intracelular de Shigella. Estamos realizando esses protocolos usando uma linhagem celular epitelial padrão, mas também adaptamos os métodos para modelos sofisticados de IG humana que agora estão disponíveis.Esses protocolos consideram cada fase da infecção de forma independente, o que é fundamental para entender os principais passos na infecção por Shigella. Eles também destacam que as análises combinadas podem facilitar uma maior compreensão da infecção por Shigella em um nível holístico.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

622 visualizações.  Massachusetts General Hospital. Shigella é um patógeno global significativo que causa taxas de infecção devastadoras a cada ano. Shigella infecta o trato gastrointestinal para causar diarreia ou disenteria. Nossa pesquisa visa melhorar nossa compreensão da infecção para ajudar a desenvolver terapêuticas mais eficazes, como vacinas e outros produtos antimicrobianos.Primeiro, modelos animais e técnicas emergentes de cultura de tecidos nos permitem entender melhor a fisiologia da infecção por Shigella e repro...

Vídeo: Autor em destaque: Avanços na compreensão e combate às infecções por Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.