Bu zona pellucida ve lentiviral gen teslim lazer perforasyon yoluyla döllenmiş fare yumurtaları ilgi genleri sunmak için kullanılan alternatif ve kullanımı kolay bir yöntemdir. Fare donör prosedürünün lazer destekli delinme işlemi, diğer virüs türlerinin veya transfeksiyon reaktiflerinin girişini kolaylaştırmak için diğer türlerin döllenmiş yumurtaları için de uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, döllenmiş fare yumurtalarının mikromanipülasyonu ve mikro enjeksiyonu için özel bir beceri gerektirmesidir.
Döllenmiş fare yumurta izolasyon prosedürü gösteren Page Myers, NIEHS Karşılaştırmalı Tıp dalından bir araştırma bilim adamı olacaktır. Çiftlemeden 16 ila 24 saat sonra, standart protokollere göre yumurtalıkları ve ovaductları vajinal fişli dişi farelerden izole edin. Tüm dokular toplandığında, her yumurtanın ampulla ayrı gözyaşı, ve kümülatif hücrelerle çevrili döllenmiş yumurta serbest, ve kümülatif hücrelerde yumurta transferi 35 milimetrelik bir çanak taze M2 ortamda bir x hyaluronidaz içeren, oda sıcaklığında üç ila beş dakika kuluçka için.
Pipet yumurta birkaç kez kümülatif hücreleri serbest bırakmak için, ve yeni bir 35 milimetrelik çanak M2 orta içeren yumurta aktarın, enzim yıkamak için pipetleme ile. Daha sonra, kalan M2 orta ve hyaluronidaz yıkamak için potasyum simpleks optimize orta veya KSOM ve pipet içeren 35 milimetrelik bir çanak içine yıkanmış yumurta aktarın. Daha sonra, 35 milimetre doku kültürü tedavi plakaları için 37 derece santigrat, % 5 karbondioksit ve oksijen ve% 90 azot iki saatlik bir denge için KSOM 50 mikrolitre ve dimetilpolisiloksane iki mililitre ile tohumlu yumurta aktarın.
Yumurta kuvöz de iken, kurmak ve XYClone lazer kalibre, üreticinin önerilerine göre. Yumurtalar hazır olduğunda, lazer mikroskop aşamasına ilk damla plaka yerleştirin ve el ile zona pellucida odaklanın. Lazer LED ışığının amaç boyunca görülebildiğinden doğruladıktan sonra, led lazer ile zona'yı hedeflemek için mikroskop aşamasını hareket ettirin ve XYClone lazerini 250 mikrosaniyeye ayarlamak için bilgisayar yazılımını kullanın.
LED ışık boyutunu uygun boyutlara ayarlayın ve her yumurtanın zona pellucida'sını lazerle üç kez delin ve üç adet 10 mikrometrelik delik açın. Bu perforasyon hızlı bir şekilde gerçekleştirmek için önemlidir, ama dikkatli, döllenmiş yumurta daha uzun süre kuvöz dışında tutamaz gibi 15 dakika. Daha sonra delikli yumurtaları iki saat daha kuvöze geri ver.
İkinci kuluçka sonunda, karıştırma olmadan konsantre lentivirus iki mikrolitre ile 50 mikrolitre KSOM damla tedavi. Ve yumurtaları dört gün boyunca kuvöze geri ver. Yumurtalar blastosisthaline geldiğinde, yaklaşık 10-15 embriyoyu KSOM'un yaklaşık iki mikrolitresine yatırmak için cerrahi olmayan bir embriyo transfer cihazı kullanın.
Embriyo transferinden 17 gün sonra, gebe farenin doğal olarak doğum almasına veya gerektiğinde sezaryenle neonatları toplamasına izin verin. Sonra, genotipleme için yavru doku toplamak, transgenez oranını belirlemek için. İzole ve transdükse fare ile döllenmiş yumurta gelişimi günlük mikroskop altında kontrol edilebilir.
Sağlıklı, tedavi edilmeyen embriyoların %60-70'i üç ila dört gün içinde blastosiste dönüşür. Lazer delikli embriyoların yaklaşık %47'si blastosistlere dönüşürken, %85'i trakane edilmiş ilgi genini ifade eder. Lazerin zonayı inceltmesini hedeflemek, bir delik açmak yerine, gelişmekte olan embriyoların, merceksi viral transdüksiyona izin verirken zona pellucida'yı kapsülleme de sağlam bir şekilde faydalanmalarını sağlar.
Bir rekombinant lentivirüs ile transdüksiyon, bir uzama faktörü copepod GFP ifade 1A organizatörü birden fazla lentiviral entegrasyonlar indükler, ve mavi led lamba altında GFP yüksek bir ifade. Bu prosedürü denerken, lentivirüslerin konak genomuna entegre olma yeteneğinin onları kararlı gen iletimi için güçlü bir araç haline getirmesine karşın, rastgele entegrasyonun da eksiyonel mutasyonlara yol açabileceğini unutmamak önemlidir. Bu teknik, genetik alanındaki araştırmacıların in vivo protein üretimi için hastalık çalışmaları veya fonksiyonel gen çalışmaları için transgenik hayvan modellerini hızla geliştirmelerine olanak sağlayabilir.
Bu işlemden sonra, immünohistokimya gibi diğer yöntemler transduced pups izole doku örnekleri üzerinde ilgi çeşitli dokularda gen ekspresyonunun yeri ve kapsamı hakkında ek sorulara cevap için yapılabilir. Lentivirüsler ile çalışan son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle lentiviruses ile çalışmak için kurumsal yönergeleri izleyin.
Kişisel koruyucu giysiler giyin ve imha edilmeden önce tüm atıkları dezenfekte edin.
