Name: preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Tüm açıklanan adımlar Biyogüvenlik Komitesi ve Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller altında yapıldı. Boston Çocuk Hastanesi düzenlenmiş aydınlık / karanlık döngüsü ve iklim kontrolü ile patojen içermeyen fare olanakları bulunmaktadır. Veterinerlik ve hayvan bakım personeli değişim kafesleri farelerin sağlığını sağlamak ve. tesisler AAALAC belgeli ve aktif Hayvan Refahı Güvencesi sertifikası (AAALAC Akreditasyon 1992/02/24 Hayvan Refahı Güvencesi numarası üzerinde Verilen.: A3303-01) var. Fareler, bir basınçlı gaz kaynağı teslim CO2 ile ötenazi uygulandı. Doku örnekleri durdurduğunu hayvanların kalp hızı, hareketi ve nefes onayladıktan sonra toplandı. Yenidoğan kemirgenler 2 ötenazi CO dayanıklı ve keskin bir makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle kurban edilmiştir. Bu yöntemler Amerikan Veteriner Medica Ötanazi Paneli tavsiyeleri ile uyumludurl Derneği. Plazmid omurgasına bir cDNA veya shRNA ekspresyon kaseti klonlanmasıyla rAAV9 Yapılar 1. Üretim Not: rAAV9 plazmid, gen aşırı ekspresyonu için kullanılan ters çevrilmiş terminal tekrarlarıdır AAV2 (ITRler), ihtiva eden tavuk TNNT2 liman için modifiye edilmiştir kalıt gen 25,26,29 ve kardiyomiyosit özel dışavurumunu sağlayan yükseltici (rAAV9.cTNT). Benzersiz Nhel ve KpnI sahalarına promotörün aşağı plazmid içine edilmiştir. Ilgi genleri kodlayan cDNA fragmanları, her iki sınırlandırma bölgeleri 25,26,29 kullanılarak rAAV9 omurgasına klonlanabilir. Burada bir örnek olarak, fare kalplerinde, GFP geninin aşırı ifadesi için rAAV9 vektörü oluşturuldu. Elde edilen plazmid, iki ITR sitelerinin (Şekil 1) tarafından sınırlanan cTnT :: GFP kasetini içermektedir. rAAV9.U6 :: shRNA yapıları 25 demonte gen için kullanılmıştır. kullanarak Tasarım shRNAsOnline ShRNA tasarım sunucuları. rAAV9.U6 :: ShRNA tavlama ve U6 promotör barındıran sınırlama enzimi sindirilmiş rAAV9 vektörlere ShRNA dizileri DNA içeren oligos bağlanması, ya da uzun menzilli PCR ve intra-moleküler Gibson montaj tabanlı &quot;kesintisiz&quot; ya oluşturulabilir inşaat 30. Elde edilen plazmid, iki ITR sitelerinin (Şekil 2) tarafından sınırlanan U6-shRNA kaseti içermelidir. Burada bir örnek olarak, rAAV9.U6 :: shRNA vektörü Trbp mRNA (: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG Trbp shRNA sekansı) demonte inşa edilmiştir. Bir mücadele shRNA, bir negatif kontrol (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG) olarak kullanılmıştır. <ol><li> rAAV9 plazmid omurgasına cDNA ya da shRNA sentezleme kaseti klonlama. Yetkili, E. Coli hücrelerine 25 içine DNA Dönüşümü. Not: rAAV9 DNA transformasyonu için kullanımı stbl2 ya stbl3 E. coli hücreleri, istenmeyen ITR rekombinasyonu azaltmak için. </li><li> I almaktransforme edilen E. coli hücrelerinden Pozitif bir klon. Lilly-Barnett ortamı, 500 ml kültür yükseltmek ve bakteri hücreleri 25-30 arasında rAAV9 plazmid ekstrakte edin. NOT: Midi / Maxi DNA (&gt; 100 ug) yüksek miktarda elde etmek için rAAV9 plazmid hazırlık. Daha önce tarif edildiği gibi virüsün üretimini önce, her zaman, sınır sindirimi ve agaroz jel elektroforezi ile AAV plasmidlerin sekansı bütünlüğünü analiz (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html). </li></ol> rAAV9 plazmid ile HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu 2. <ol><li> doğrusal polietilenimin (PEI) çözeltisi 1 ug / ul hazırlayın. Endotoksin içermeyen dH 70-80 ° C&#39;ye kadar ısıtılmış olan 2 O PEI toz eritilir. Oda sıcaklığına kadar soğutulması, 1 M HCI ile pH 7.0&#39;a Çözeltinin nötralize edilmesi. Filtre sterilize (0.22 mikron) çözümüdür. 1 mcg / ml PEI stok solüsyonu (1.400 ul / tüp) alikotu ve solut saklamak-20 ° C&#39;de iyonu. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür HEK293 hücreleri. Kültür 5 ±% 0.5 karbon dioksit ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri (CO2). </li><li> 2 seyreltme: 0. günde, on 150 mm&#39;lik tabaklar içerisinde bir 1 bölme&gt;% 90 konfluent hücreler tarafından transfeksiyon önce 18-20 saat HEK293 hücreleri plaka. Not: 1. günde, hücreler,% 90 izdiham ulaşmalıdır. </li><li> Gün 1 &#39;de, rAAV9 plasmid (ör rAAV9.cTNT :: GFP veya rAAV6.U6 :: shRNA oluşturur), Ad-yardımcı plazmit ve PEI 25,26,29 kullanarak AAV Rep / Kapak plazmidi ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. <ol><li> % 90 izdiham hücre 10 yemekler için, 50-ml santrifüj tüpü içinde Ad-yardımcı plazmit 70 AAV Rep / Cap plazmidi ug rAAV9 plazmid PF 70 ug ve 200 ug karıştırın. </li><li> Hücreler daha az konfluent iseniz, orantılı DNA miktarını ayarlamak. Hücreler% 75 konfluent altındadır Örneğin, azaltmakorantılı DNA miktarı (adım 2.4.1 gösterilen miktarın 75/90): 70 x 75/90 = AAV-Rep / Cap plazmid 58.3 mikrogram, rAAV9 plazmid x 75/90 = 58.3 mikrogram 70 ve 200 x mix 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde Reklam-yardımcı plazmidin 75/90 = 166.7 ug. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe (FBS&#39;siz) RT DMEM 49 ml ilave edilir ve iyice karıştırılır. </li><li> PEI yapmak için PEI solüsyonu 1.360 ul ekleyin: DNA oranının (h / a) 4 olması: 1 arasındadır. İyice karıştırın. 30 dakika - 15, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> (On 150 mm&#39;lik tabaklar karışımın 50 mi), her 150 mm tabak için adım 2.4.4 hazırlanan karışım, 5 ml. </li></ol></li><li> Kültür 60-72 saat 5 ±% 0.5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri. </li></ol> 3. Hasat transfekte HEK293 hücreleri ve rAAV9 Vektörler saflaştırılması <ol><li> Hücreler, transfeksiyondan sonra, 60-72 saat hasat edilir. Çıkarmak ve yukarı pipetleme ve kültür ortamı ile aşağı yemekleri hücreleri askıya. steril tüm hücre süspansiyonları aktarın50 ml tüpler. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri Santrifüj. Her bir tüp içinde 5 ml PBS ile hücre pelletini ve bir 50 ml tüp içine tüm hücre süspansiyonları birleştirir. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri Santrifüj. süpernatant atın. Bu adımda, -80 ° C de hücre pelletini depolamak ya da hemen adımda 3,4-3,15 tarif edildiği gibi, pelet AAV saflaştırılması. </li><li> 150 mM NaCl ve 20 mM Tris-HCl, pH 8.0: lizis tamponu hazırlayın. Filtre sterilize (0.22 uM). 4 ° C&#39;de tampon saklayın. </li><li> liziz tamponu 10 ml pelletini. </li><li> daha sonra bunun çözülme 37 ° C&#39;de, 80 ° C&#39;de ya da kuru buz / etanol banyosu içinde lizat dondurun. 1 dakika vorteksleyin. Freeze ve lizat 3 kez Çözülme. </li><li> Çözülmüş lizat MgCI2 solüsyonu (1 mm lizatında MgCl2 nihai konsantrasyon olun). 250 U / ml bir son konsantrasyona kadar nükleaz ekleyin. DNA / Protein AGGR çözünmesi için 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edinegation. NOT: DNA / protein agregasyonu, nükleaz veya endonükleaz tedaviden sonra çözülmüş olsun yoksa Dounce Lizatlar 20 kez homojenize. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 4,800 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant toplayın. </li><li> Bu arada, iyodiksanol gradyan çözeltisi hazırlayın: <ol><li> 10x 5 ml PBS, 1 M MgCl2, 0.05 mi, 1 M KCI, 0.125 mi, 5 M NaCI, 10 ml ve gradyan ortam ofdensity 12,5 ml karıştırma gradyan çözeltisi% 17 hazırlayın. H2O ile 50 ml toplam hacmini ayarlamak </li><li> 10x 5 ml PBS, 1 M MgCl2, 0.05 mi, 1 M KCI, 0.125 mi, yoğunluk gradyanlı ortam 20 ml ve% 0.5, 0.2 ml (a / h) Fenol Kırmızısı karıştırılarak% 25 çözelti hazırlayın. H2O ile 50 ml toplam hacmini ayarlamak </li><li> 10x 5 ml PBS, 0.05, 1 M MgCl2 mL, 1 M KCI, 0.125 mi, ve yoğunluk dereceli ortamının 33.3 mi karıştırılarak% 40 çözelti hazırlayın. kullanılarak 50 ml toplam hacmini ayarlamakH2O </li><li> Karıştırılarak% 60 çözelti hazırlayın 0.05 ml 1 M MgCl2, 1 M KCI, 0.125 ml, yoğunluk gradyanlı ortam, 50 ml ve 0.1 ml% 0.5 (ağırlık / hacim) Fenol Kırmızısı. </li></ol></li><li> Bir enjektör ile, alttan başlayarak,% 60 5% 17 mi,% 25, ​​5 ml,% 40, 5 ml ve 5 ml için polipropilen tüp içine iyodiksanol gradyan çözeltisi yükleyin. gradyanın tepesinde Aşama 3,8 (14-16 mi) içinde elde edilen tüm lizat yükleyin. alttan üste doğru listelenmiş gradyan,% 60,% 40,% 25,% 17, ve lizat tabakasıdır. lizis tamponu ile tüp doldurun ve mantar ile örtün. </li><li> 16 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 185,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> bir şırınga ile viral kısmını (% 40 katman) Hasat. sadece% 40 katman aspire,% 40 ve% 60 fraksiyonları arasındaki kesişme içine iğne (21 gauge) yerleştirin. NOT:% 25 tabakasının HERHANGİ aspirasyon kaçının. </li><li> Sterilize polioksietilen-polyoxypro viral kısmını karıştırın15 ml&#39;lik bir toplam hacme kadar: pylene blok kopolimeri PBS solüsyonu (10,000 PBS içinde seyreltilmiş,% 10 polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri hazır 1). Filtre tüp (cut-off MW = 100 kD) içine karışımı yerleştirin. 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> altta çözüm atın. 15 ml&#39;lik toplam hacme kadar polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri, PBS çözeltisi ile filtre tüp doldurun. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. saflaştırılmış rAAV9 virüsü (filtresinin üzerine fraksiyonu) toplayın. </li><li> 1.7 ml tüpler filtre tüpünde saflaştırılmıştır rAAV9 aktarın. Saflaştırılmış rAAV9 bölüm (100 - AAV hacmi ve titre bağlı olarak 400 ul / tüp), ve -80 ° C &#39;de virüs saklayın. NOT: tekrarlanan donma-çözülür kaçının. </li></ol> rAAV9 titresi 4. Ölçüm <ol><li> Standart DNA örnekleri hazırlayın. <ol><li> özel ve etkili bir PCR TasarımrAAV9 vektörleri için primerler ve PCR durumunu optimize eder. Not: &quot;: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG;: İleri TCGGACGGAGATACGTGAGT&quot; Bu çalışmada kullanılan primerlerdir. PCR reaksiyonu, aşağıdaki koşullar ile yapıldı: Initial doğasını değiştiren 3 dakika boyunca 95 ° C&#39;de; 20 saniye, 15 saniye, 60 ° C&#39;de ve 10 saniye boyunca 72 ° C&#39;de, 95 ° C&#39;de 35 döngü; ve 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son uzatma. RAAV9 vektöründe ilave sekansı PCR 31 özgünlüğünü ve verimliliğini etkileyebilir Ancak, optimize edilmiş primerleri ve PCR koşulları, plazmid-özeldir. </li><li> Adım 4.1.1 gösterilen şartlara PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Bir jel özütleme kiti ile PCR ürünü saflaştırılır. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, saflaştırılmış DNA konsantrasyonu ölçümü. PCR ürününün molekül ağırlığı / uzunluğuna göre DNA moleküler sayıda konsantrasyonu hesaplanır. <ol><li> aşağıdaki denklem kullanılarak moleküler konsantrasyonu hesaplayın: moMolecular konsantrasyonu (DNA molekülleri veya bunların fragmanları / ml) = 6.23 x 10 23 mol-1 X Kon. x 10 -6 / MW. Not: (6.23 x 10 23 mol-1 Avagadro sayısı Kon .: DNA konsantrasyonu ng / ml; MW .: g / mol molekül ağırlığı). PCR ürününün elde konsantrasyonu, 100 ug / ml ve uzunluğu 200 bp Örneğin, iki-şeritli DNA molekül ağırlığı, her bir nükleotitden 2 x 200 x 310 = 124,000 (ortalama molekül ağırlığıdır tek-şeritli DNA, yaklaşık 310 g / mol) &#39;dir. Moleküler konsantrasyonu (DNA molekülleri / mi) 6.23 x 10 23 mol-1 X 100 ug / ml x 10 6 / 124.000 g / mol = 5.18 x 10 14 DNA molekülleri / ml =. </li><li> 10 ila 13 molekül / ml, 10 ila 12 molekül / ml, 10 11 molekülleri / ml, 10 10 molekülleri / ml, 10 9 molekülleri / ml, 10 konsantrasyonları ile, DNA fragmanının bir seyreltme serisi gerçekleştirmek ve standart örnekleri hazırlamak <sup&gt; 8 molekülleri / ml ve 10 7 molekülleri / ml olmuştur. (Adım 4.6, qPCR) kantitatif PCR için her bir standart numune için solüsyonun 1 ul kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> 10x DNAz tamponu, 5 ul, DNAz 1 ul (10,000 U / ml) ve GKD 2 O. 39 ul toplam hacim 50 ul olmalıdır saflaştınlmış rAAV9 çözeltisi 5 ul karıştırın. </li><li> Kalıntı paketlenmemiş plazmid DNA çıkarmak için 30 dakika için 37 ° C &#39;de şişe inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de DNAz inaktive. , Çözelti önce soğumaya H2O 44 ul 10x DNAz tampon 5 ul proteinaz K ile stokunun 1 ul (10 mg / ml) ekleyin. </li><li> 2 saat boyunca 50 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. reaksiyonu durdurun ve 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de Proteinaz K etkisiz hale getirirler. </li><li> kantitatif PCR (qPCR) deneyi için örnek 1 ul kullanın. titresi hesaplayın. <ol><li> Numuneler fr kullanarak adım 4.1.1 tasarlanmış primerler ile kantitatif PCR (qPCR) çalıştırınom adımı 4.1.4 (standart numune) ve aşama 4.5 ila (örnekler, bundan). <ol><li> Her bir reaksiyon için, (Taq polimeraz, dNTP karışımı, tampon, MgCl2 ve yeşil boya ihtiva eder) 2x Yeşil ana karışımı 10 ul ileri primer (5 uM), 0.5 ul ters primeri (5 uM), 0.5 ul karıştırın H2O 8 ul ve örnek 1 ul ölçülecek. aşağıdaki koşullarda qPCR gerçekleştirmek: 2 dakika ve 10 dakika boyunca 95 ° C, 50 ° C &#39;de numuneler tutun; 15 sn için ve 1 dakika boyunca 60 ° C &#39;de 95 ° C&#39; de 40 döngü gerçekleştirmek; erime aşaması için, 30 saniye ve 15 saniye süreyle 60 ° C, 95 ° C &#39;de numuneler inkübe edin. Standart numuneler (Şekil 3) C T numaraları dayalı standart eğri oluşturmak. </li></ol></li><li> standart bir eğriye karşı AAV numunenin molekül konsantrasyon / titresi hesaplanır. rAAV9 tek iplikli DNA genomu, bu nedenle molekül konsantrasyonundan 2 kat daha yüksek olacakHesaplanan değer (2x gücü (10, y), Şekil 3B). Buna ek olarak, arıtılmış, rAAV9 titresi bağlı DNase ve proteinaz K reaksiyonlarda virüsü (100 ul toplam 5 ul) 1:20 seyreltme hesaplama elde edilen daha büyük bir değere 20 kat olacaktır. </li></ol></li></ol> Heart Yenidoğan Farelerde ve Gen İfadesi Tahliller 5. rAAV9 Enjeksiyon <ol><li> polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri, PBS çözeltisi içinde rAAV9 çalışma çözümleri hazırlayın. 1-7 x 10 12 parçacıklar / ml titreleri ile virüs stok yapmak. NOT: deri altı enjeksiyonu ile her doğum sonrası gün 0.5-1.5 fare içine rAAV9 çözeltisi 50-70 ul sunun. etkin gen ifadesinin veya demonte elde etmek için, enjekte edilen AAV miktarını optimize etmek için her bir çalışma için bir pilot testi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. önyargı en aza indirmek için her çalışma için rAAV9.cTNT :: Luc veya rAAV9.U6 :: karıştıran kontrolleri aynı miktarda kullanın. NOT: 1-1.5 kullanılanx 10 11 parçacıklar / yavru aşırı ekspresyonunun ve 2.5 - doğum sonrası gün 0.5-1.5 mi ce) içinde demonte için 5 x 10 11 parçacıklar / yavru. </li><li> Deri altı enjeksiyonu ile P0.5-P2.5 de rAAV9 neonatal fareler davranın. <ol><li> rAAV9 çözümü ile bir 29G1 / 2, 0.33 x 12.7 mm insülin şırınga önceden doldurun. Hava kabarcıklarını çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> başparmak ve işaret parmağı ile bir yandan cryo anestezi yavru tutun. Enjeksiyondan önce, steril durumunu korumak için% 70 izopropil alkol ile doymuş bir çubukla sopayla yavru arka cilt tokatlamak. 5 ila 10 ° &#39;lik bir açı ile hayvan ön-dorsal subkütisine bir şırınga iğnesi yerleştirin. insülin şırınga kullanarak rAAV9 çözeltisi 50-70 ul enjekte edilir. NOT: rAAV9 da intraperitoneal veya intravenöz enjeksiyon 26,27 aracılığıyla fare teslim edilebilir. kalp teslim genlerin etkin ekspresyonu elde edilebilir. Bununla birlikte, intraperitonal enjekteİyon bazen karaciğer sızan ifade neden olabilir. enjeksiyonundan sonra, yavruların durumu her gün izlendi. </li></ol></li><li> Kalp gen ekspresyonunun seviyesi qPCR, immünofloresan veya western blot ile izlenebilir (Örnek sonuçlar Şekil 4&#39;te gösterilmiştir ve 5) 25,26. Not: Fareler, sıkıştırılmış gaz kaynağından teslim CO2 ile ötenazi uygulandı. Doku örnekleri hayvanların kalp atış hızı, hareket ve solunum sona olduğu doğrulandıktan sonra toplanmıştır. Yenidoğan kemirgenler 2 ötenazi CO dayanıklı ve keskin bir makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle kurban edilmiştir. yöntem Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli önerileri ile tutarlıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Primrose, S. B., Twyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+tool+for+conditional+gene+expression+and+knockdown.">A versatile tool for conditional gene expression and knockdown.</a> Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).</li><li>Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Gene+Delivery+Systems.">Advances in Gene Delivery Systems.</a> BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).</li><li>Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+delivery+systems.">Advances in gene delivery systems.</a> Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).</li><li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+gene+delivery+for+human+gene+therapy.">Virus-mediated gene delivery for human gene therapy.</a> J. Control Release. 161, 377-388 (2012).</li><li>Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+gene+therapy+approaches+for+osteosarcoma+using+viral+vectors:+review.">Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review.</a> Bone. 40, 797-812 (2007).</li><li>De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+c-Kit+signaling+pathway+in+mouse+primordial+germ+cells+by+retroviral-mediated+gene+transfer.">Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).</li><li>Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+delivery+into+male+germ+line+stem+cells.">Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells.</a> FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).</li><li>Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell+cycle+status+on+early+events+in+retroviral+replication.">Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication.</a> J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).</li><li>Escors, D., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+in+gene+therapy:+their+current+status+and+future+potential.">Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).</li><li>M&#225;trai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+lentiviral+vector+development+and+applications.">Recent advances in lentiviral vector development and applications.</a> Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).</li><li>Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+retroviral+genome+and+the+packaging.">Structural dynamics of retroviral genome and the packaging.</a> Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).</li><li>Douglas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery.</a> Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).</li><li>Armend&#225;riz-Borunda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+first+generation+adenoviral+vectors+for+preclinical+protocols:+amplification,+purification+and+functional+titration.">Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration.</a> J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).</li><li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery.</a> J Gene Med. 1, 166-175 (1999).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+transfer+in+porcine+myocardium+after+coronary+infusion+of+an+adeno-associated+virus+vector.">Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector.</a> Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).</li><li>Kaspar, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+gene+transfer+and+long-term+expression+following+intracoronary+delivery+of+adeno-associated+virus.">Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trbp+regulates+heart+function+through+microRNA-mediated+Sox6+repression.">Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression.</a> Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-specific+YAP+activation+improves+cardiac+function+and+survival+in+an+experimental+murine+MI+model.">Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model.</a> Circ. Res. 115, 354-363 (2014).</li><li>Wahlquist, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+miR-25+improves+cardiac+contractility+in+the+failing+heart.">Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart.</a> Nature. 508, 531-535 (2014).</li><li>Carroll, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adult+cardiac-specific+gene+deletion+with+CRISPR/Cas9.">A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).</li><li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy.">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342, 111-114 (2013).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro.">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li><li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-dependent+packaging+of+large+genes+in+adeno-associated+viral+vectors+results+in+effective+gene+delivery+in+mice.">Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).</li><li>Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+trans-splicing+as+a+means+for+viral+vector-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).</li><li>Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart,+but+not+liver.">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894 (2013).</li><li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins.">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Plazmid, inşaat sırasında istenmeyen ITR rekombinasyonu azaltmak için çok önemlidir. virüs oluşturmadan önce, bir zaman kısıtlaması sindirim ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak AAV plazmid ITR bütünlüğünü izlemek gerekir. % 100 sağlam plazmidler elde etmek mümkün değildir, ancak rekombinasyon oranı mümkün olduğunca en aza indirilmelidir. Az% 20 başarı rAAV9 paket için kabul edilebilir. Dikkat çekici bir alt sallayarak hızla (180-200 rpm) ile düşük sıcaklıkta (30 ° C) bakteriler...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Çeşitli biyolojik sistemlerde, belirli genlerin dışavurumu ya da aktivitesini kontrol gen fonksiyonu 1 çalışmasında değerli bir strateji haline gelmiştir. Bu amacı gerçekleştirmek doğrudan bir aracı nükleotid dizilerini işlemek ve mutant alelleri üretmektir. canlı hücre genomuna kesin ve hedeflenen bir değişiklik yapmak hala olmasına rağmen Bir zaman alıcı ve emek yoğun bir uygulamadır, güçlü TALEN ve CRISPR / Cas9 araçlarının geliştirilmesi genom düzenleme 2-5 yeni bir dönem açtı. Gen manipülasyonu için daha rutin laboratuvar yöntemi genetik malzemeler (DNA&#39;lar ve kodlama dizileri veya siRNA&#39;lar / shRNAs içeren RNA&#39;lar) açık veya ilgi 1,6 gen (ler) demonte hücrelerin içine giriş odaklanmıştır. Pek çok durumda, gen manipülasyonu için büyük bir darboğaz hücrelerine DNA, RNA ya da protein verilmesidir. In vitro çalışmalarda dikkate alarak, verimli transfecti ilesistemlerde çok kültürlenmiş hücre çizgileri kurulmuştur. Bununla birlikte, özellikle de fare modelinde in vivo gen aktarım daha zordur. Eksojen reaktiflerin etkili biçimde hücreye alınması elde edilmesi amacıyla bypass gereken ekstra ve hücre içi engellerin bir dizi işlem bulunmaktadır. Ek engeller, hızlı temizleme ve teslim malzemeler 7,8 kısa süreli içerir. Bu sorunları aşmak için bir strateji, in vivo gen aktarımı için &quot;taşıyıcılar&quot; veya &quot;araçlar&quot; gibi viral vektörler kullanmaktır. Virüslerin doğal olarak gelişmiş iletim özellikleri hücre 7,9,10 söz konusu bir genin etkin bir dağıtımını sağlar. Viral vektörlerin çok sayıda türleri geliştirilmiş ve farelerde, farklı hücre tipleri ve organların in vivo gen manipülasyonu esnek olanak edilmiştir. En yaygın olarak kullanılan viral sistemler retrovirüs, lentivirüs, adenovirüs ve adeno-ilişkili virüs (AAV) dahildir <s&gt; 11 kadar. Retrovirüsler, tek dallı bir RNA virüsleridir ve hedef hücre ve organ 12-14 transdüksiyona genlerin yaşam boyu ifadesi için potansiyel sağlamaktadır mitotik bölünmesi sırasında istikrarlı bir şekilde konukçu hücre genomuna genetik malzemenin neden olabilir. Bununla birlikte, retrovirüsler, çok çeşitli, sadece bölünen hücreleri enfekte eder ve bölünmeyen hücreleri onların etkinliği 15 derece düşüktür. Bu gen aktarımı için bunların kullanımını sınırlar. Lentivirüs Retroviridae ailesinin bir cinsidir. Diğer retrovirüsler arasında farklı, lentivirüs, her iki bölme ve bölünmeyen hücreleri enfekte edebilir ve yaygın olarak post-mitotik ve yüksek farklılaşmış hücrelerin 16 gen transferi için kullanılmıştır. Lentivirüs yaşam döngüsü, konakçı genomuna vektör DNA&#39;nın entegrasyonu içermektedir. Bu nedenle, lentivirüs aracılığıyla gen teslimi transduse genetik elementlerin 16-18 kararlı ve uzun süreli ifadesini sağlar. Ancak, bu özellik bir çift e temsil edebilirVektör DNA &#39;nın entegrasyonu girmeyle mutagenez neden olabileceğinden, bu virüslerin kullanımı dged kılıcı gen ekspresyonunu değiştirmek için ve ev sahibi hücrelerde artefakt etkilere neden olabilir. Adenovirüs başka yaygın olarak kullanılan gen aktarım sistemidir. Retrovirüsler ve lentivirüsler farklı olarak, Adenovirüsler, entegre olmayan ve konakçı hücreler 8,10,11,19 genomik bütünlüğü ile karışmaz. Buna ek olarak, Adenovirüsler, bir çok hücre tipinde içine DNA transfekte olabilir ve enfeksiyon aktif hücre bölünmesi 19 bağlı değildir. Viral vektörler yeteneği 19,20 çoğaltılması zorunda adenovirüslerin başka önemli özelliği, vektör arınma kolaylığıdır. Bununla birlikte, bu sistemin en önemli uyarı adenovirüslerin, özellikle gen tedavisi çalışmalarında, birçok araştırmalarda kullanımını kısıtlayan, hedef hücrelerin ve organlar 19 güçlü bir bağışıklık tepkilerini tetikler olabilir. Bu farklı tip ile karşılaştırıldığındaViral vektörlerin s, rekombinant adeno-bağlantılı virüs (AAV) ideal bir gen iletim sisteminin 21,22 olduğu görülmektedir. Minimal immünojenite ve patojenitesini 23,24 sergiler. Buna ek olarak, rAAV bölünmesi ve bölünmeyen hücreleri hem de dahil olmak üzere hücre tiplerinin geniş bir yelpazede enfekte eder. Çoğu durumda, rAAV ana genomlarına entegre değildir; Bu nedenle, hedef hücrelerde arzu genetik ya da genomik değişiklik riski düşüktür 22&#39;dir. Son zamanlarda, rAAV sistemleri başarıyla fare kalp kası 23,25-29, DNA kodlayan proteinlerin miRNA&#39;lar, shRNAs ve CRISPR-gRNAs in vivo verilmesi için kullanılmaktadır. Bu metodoloji kardiyovasküler araştırma alanında temel araştırmalar ve gen tedavisi çalışmaları kolaylaştırmıştır. Burada detaylı bir işlemi etkin bir şekilde tarif edilmiştir aşın veya fare kalplerinde ilgi genleri demonte rAAV9 vektörleri üretir. Protokol, basit ve etkili bir yöntem temin etmektedirfare deneysel modellerde kalp gen ifadesi manipüle.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>#23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td># 362183</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease, ultrapure</td><td>SIGMA</td><td>#E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Medium(Iodixanol)</td><td>SIGMA</td><td>#D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>#UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pipetting needle with 90&amp;deg; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td><td>SIGMA</td><td>#CAD7942-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution (Pluronic&amp;reg; F-68 solution)</td><td>SIGMA</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA</td><td>3115828001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge System</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>rAAV9 vector</td><td>Penn Vector Core</td><td>P1967</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

sıçan modellerinde genetik materyallerin miyokard teslim yoluyla ifade ya da belirli genlerin aktivitesini kontrol eden gen fonksiyonlarının soruşturma izin verir. merkezinde Bunların terapötik potansiyeli de belirlenebilir. Fare kalp in vivo molekül müdahale sınırlı yaklaşımlar bulunmaktadır. Rekombinant adeno-bağlantılı virüsü (AAV) tabanlı genom mühendisliği in vivo kardiyak gen manipülasyonu için gerekli bir araç olarak kullanılmıştır. Bu teknolojinin belirli avantajları minimal yüksek verimlilik, yüksek özgüllük, düşük genomik entegrasyon oranı dahil immünojenisite ve minimal patojenite. Burada, rAAV9 vektörleri, inşa paket ve arındırmak için detaylı bir prosedür açıklanmıştır. Yenidoğan yavruların halinde rAAV9 deri altı enjeksiyonu, karaciğer ve diğer dokularında güçlü bir ifade ya da fare kalbinde ilgili gen (ler) in etkin bir devirme ile sonuçlanır, fakat. Kalp-specifi kullanarakCı TnnT2 promoteri, kalp GFP geninin yüksek elde edildi. Ayrıca, rAAV9-U6-ShRNA kullanılmıştır zaman mRNA kalbinde inhibe edilmiştir hedef. rAAV9 teknoloji bilgisi çalışma kardiyovasküler araştırmalar için de faydalı olabilir.

RAAV9.cTNT :: GFP veya rAAV9.U6 :: shRNA plasmidlerin rAAV9 yapımı için strateji Şekil sırasıyla 1 ve 2, gösterilmiştir. Örnek olarak, rAAV9 vektörü, fare kalplerinde GFP geninin aşın ifade etmek üzere oluşturuldu. Elde edilen plazmid, iki ITR sitelerinin (Şekil 1) tarafından sınırlanan cTnT :: GFP kasetini içermektedir. RAAV9.U6 :: ShRNA vektör Trbp mRNA demonte inşa edilmiştir (Şekil 2)<...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.7K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital. In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described. 

Video: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genetik

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biyoloji

Fare Kalplerinde Kardiyak Hücrelerin Elektroporasyona Dayalı Transgenezi

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Yazar Spotlight: Hızlı Gen Taraması için Kardiyak Hücre Transgenezi

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Gelişim Biyolojisi

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Tıp

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasts can be reprogrammed into induced cardiomyocytes (iCMs). These iCMs, when generated in situ in an infarcted heart, integrate electrically and mechanically with the surrounding myocardium, leading to a reduction in scar size and an improvement in heart function. Because of the relatively low reprogramming efficiency, purity, and quality of the iCMs, characterization of iCMs remains a challenge. The currently used methods in this field, including flow cytometry, immunocytochemistry, and qPCR, mainly focus on cardiac-specific gene and protein expression but not on the functional maturation of iCMs. Triggered by action potentials, the opening of voltage-gated calcium channels in cardiomyocytes leads to a rapid influx of calcium into the cell. Therefore, quantifying the rate of calcium influx is a promising method to evaluate cardiomyocyte function. Here, the protocol introduces a method to evaluate iCM function by calcium (Ca2+) flux. An &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mouse strain was established by crossing Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referred to as Myh6-Cre below) with Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mice. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) from P0-P2 neonatal mice were isolated and cultured in vitro, and a polycistronic construction of MGT was introduced to NCFs, which led to their reprogramming to iCMs. Because only successfully reprogrammed iCMs will express GCaMP3 reporter, the functional maturation of iCMs can be visually assessed by Ca2+ flux with fluorescence microscopy. Compared with un-reprogrammed NCFs, NCF-iCMs showed significant calcium transient flux and spontaneous contraction, similar to CMs. This protocol describes in detail the mouse strain establishment, isolation and selection of neonatal mice hearts, NCF isolation, production of retrovirus for cardiac reprogramming, iCM induction, the evaluation of iCM Ca2+ flux using our reporter line, and related statistical analysis and data presentation. It is expected that the methods described here will provide a valuable platform to assess the functional maturation of iCMs for cardiac reprogramming studies.

We describe here, the establishment and application of an Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mouse reporter line for cardiac reprogramming assessment. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) isolated from the mouse strain are converted into induced cardiomyocytes (iCMs), allowing for convenient and efficient evaluation of reprogramming efficiency and functional maturation of iCMs via calcium (Ca2+) flux.

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Koroid pleksusta seçici gen susturma

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Yazar Spotlight: Koroid Pleksus Araştırmaları için Gen İfadesi Manipülasyon Tekniklerinde İçgörüler ve Yenilikler 

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

Koroid pleksustaki genlerin hedefli yıkımı

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Koroid pleksustaki genlerin hedefli yıkımı

Koroid pleksustaki genlerin hedefli yıkımı