Araştırmamız, ALS veya FTLD-TDP gibi sitoplazmada nükleer protein TDP-43'ün birikmesi ile karakterize ilerleyici nörodejeneratif hastalıklara odaklanmaktadır. TDP-43 patolojilerinin beyinde prion benzeri bir şekilde nasıl yayıldığını anlamayı amaçlıyoruz. Daha önce, TDP-43'ün hücre dışı veziküller yoluyla salınmasına, otofajinin düzensizliğinin aracılık ettiğini bulmuşuz.
FTLD-TDP'nin progranulini bu süreci kolaylaştırır. Bir sonraki zorluk, otofajinin TDP-43 içeren hücre dışı veziküllerin üretimini ve salınımını nasıl düzenlediğini açıklığa kavuşturmaktır, bu da ALS veya FTLD-TDP için terapötik hedeflerin keşfedilmesine yol açabilir. Başlamak için, kültürlenmiş HeLa hücrelerini alın, bir hücre sayacı kullanarak sayın ve bir kültür ortamı içeren altı santimetrelik bir plaka üzerinde altı hücrenin gücüne bir çarpı on tohumlayın.
Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin. Ardından, 20 mikromolar bir siRNA çözeltisi hazırlayın. Çözelti A'yı hazırlamak için 100 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını ve üç mikrolitre siRNA'yı düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.Ardından, Çözelti B'yi hazırlamak için düşük retansiyonlu bir tüpte 100 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve beş mikrolitre transfeksiyon reaktifini karıştırın.
Şimdi Çözelti A ve B'nin karışımını HeLa hücrelerini kültürlemek için kullanılan ortama ekleyin ve 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri 500 mikrolitre% 0.25 tripsin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve beş dakika boyunca kontrollü nem ile bir milimolar EDTA çözeltisine maruz bırakın. Daha sonra, hücrelere 2,5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve 20 mikrolitrelik pipet ucu takılı bir Pasteur transfer pipeti kullanarak tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
Hücreleri saydıktan sonra, on santimetrelik bir plaka üzerinde altı hücrenin gücüne bir kez on tohumlayın ve daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, araç veya 100 nanomolar bafilomisin A1 içeren kültür ortamını hazırlayın. Daha sonra hücreleri, araç veya 100 nanomolar bafilomisin A1 içeren ortama maruz bırakın ve 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, tüm kültür ortamını 10 santimetrelik plakadan toplayın.
Toplanan ortamı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını gidermek için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. P1 hücre dışı vezikül fraksiyonunu izole etmek için, süpernatanı 3.000 G'de santrifüjlemeden sonra bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir saat boyunca dört santigrat derecede 20.000 G'de santrifüjleyin.
P2 hücre dışı vezikül fraksiyonunun izolasyonu için, süpernatanı 20.000 G'de santrifüjlemeden sonra bir ultra santrifüj tüpüne aktarın. Bir saat boyunca dört santigrat derecede 110.000 G'de santrifüjleyin. Tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendili ile sildikten sonra, P1 hücre dışı vezikül fraksiyonunu hazırlamak için santrifüj tüpünde kalan peletleri 50 mikrolitre iki zamanlı numune tamponunda yeniden süspanse edin.
Daha sonra süpernatanı boşaltarak çıkarın. Tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendiliyle silin ve P2 hücre dışı vezikül fraksiyonunu hazırlamak için ultrasantrifüj tüpünde kalan peletleri 50 mikrolitre iki zamanlı numune tamponunda yeniden süspanse edin. P1 ve P2 hücre dışı vezikül fraksiyonlarını 100 santigrat derecede bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin.
Kültür ortamını 10 santimetrelik plakadan 15 mililitrelik bir tüpe aktardıktan sonra, hücreleri 10 santimetrelik tabakta PBS ile yıkayın. Daha sonra hücreleri% 5 karbondioksit ve beş dakika boyunca% 5 karbondioksit ve kontrollü nem ile 37 derecede iki mililitre% 0.25 tripsin ve bir milimolar EDTA çözeltisine maruz bırakın. Hücrelere sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin.
200 mikrolitrelik pipet ucu takılı bir Pasteur transfer pipeti kullanarak, tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için hücreleri pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.000 G'de santrifüjleyin. Ardından bir aspiratör kullanarak süpernatanı çıkarın.
PBS'yi hücre peletine ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000 G'de santrifüjleyin. PBS'yi çıkardıktan sonra, hücre peletini% 1 sarkozil içeren bir mililitre A68 tamponunda sonikleştirin. 300 mikrolitre hücre lizatını 100 mikrolitre dört zamanlı numune tamponu ile karıştırın.
Hücre fraksiyonunu hazırlamak için karışımı 100 santigrat derecede bir ısı bloğu üzerinde 10 dakika inkübe edin.
