우리의 연구는 ALS 또는 FTLD-TDP와 같이 세포질에 핵 단백질 TDP-43이 축적되는 것을 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질환에 중점을 둡니다. 우리는 TDP-43 병리가 어떻게 프리온과 같은 방식으로 뇌를 통해 퍼지는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 우리는 이전에 세포외 소포체를 통한 TDP-43의 방출이 자가포식 조절 장애에 의해 매개된다는 것을 발견했습니다.
FTLD-TDP의 Progranulin는 이 과정을 촉진합니다. 다음 과제는 자가포식이 TDP-43을 포함하는 세포외 소포체의 생산 및 방출을 어떻게 조절하는지 밝히는 것이며, 이는 ALS 또는 FTLD-TDP에 대한 치료 표적의 발견으로 이어질 수 있습니다. 먼저 배양된 HeLa 세포를 가져다가 세포 카운터를 사용하여 수를 세고 배양 배지가 들어 있는 6cm 플레이트에 10을 10배로 파종하여 세포 6개의 거듭제곱을 합니다.
섭씨 37도에서 이산화탄소 5%와 습도를 조절하여 24시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 20마이크로몰 siRNA 용액을 준비합니다. 저농도 튜브에 100 마이크로리터의 환원 혈청 배지와 3 마이크로리터의 siRNA를 혼합하여 용액 A를 준비합니다.그런 다음 저농도 튜브에 100 마이크로리터의 환원 혈청 배지와 5 마이크로리터의 transfection 시약을 혼합하여 용액 B를 준비합니다.그런 다음 용액 A와 용액 B를 혼합한 다음 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
이제 용액 A와 B의 혼합물을 HeLa 세포 배양에 사용되는 배지에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 다음날 PBS로 세포를 세척하고 세포를 0.25% 트립신 500마이크로리터와 1밀리몰 EDTA 용액에 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 5분 동안 습도를 조절합니다. 다음으로, 배양 배지 2.5ml를 세포에 추가하고 20마이크로리터 피펫 팁이 부착된 파스퇴르 전사 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
세포를 세는 후 10cm 접시에 1 곱하기 10을 6 개의 세포의 거듭 제곱으로 파종하고 앞서 설명한 것처럼 부화합니다. 배양이 끝나면 비히클 또는 100 나노몰 바필로마이신 A1을 함유한 배양 배지를 준비합니다. 그런 다음 세포를 차량 또는 100 나노몰 바필로마이신 A1을 함유한 배지에 노출시키고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 10cm 플레이트에서 모든 배양 배지를 수집합니다.
수집된 매체를 15밀리리터 튜브에 넣고 3, 000G에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. P1 extracellular 소포 분획을 고립시키기 위하여는, 3에 원심분리 후에 상층액을 분리 관으로 000 G 옮기십시오. 20, 000 G에 튜브를 1시간 동안 섭씨 4도에서 원심분리기.
P2 extracellular 소포 분획의 고립을 위해, 20에 원심분리법 후에 상층액을 매우 분리기 관으로 000 G를 옮긴다. 110, 000 G에 1 시간 동안 4 섭씨 온도에 그것을 분리하십시오. 실험실 물티슈로 튜브 내부의 과도한 수분을 닦아낸 후 원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿을 50마이크로리터의 2회 시료 완충액에 재현탁시켜 P1 세포외 소포체 분획을 준비합니다.
그런 다음 디캔팅으로 상층액을 제거합니다. 실험실 물티슈로 튜브 내부의 과도한 수분을 닦아내고 초원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿을 50마이크로리터의 2회 샘플 버퍼에 재현탁시켜 P2 세포외 소포체 분획을 준비합니다. P1 및 P2 세포외 소포체 분획을 섭씨 100도에서 열 블록에서 10분 동안 배양합니다.
배양 배지를 10cm 플레이트에서 15mm 튜브로 옮긴 후 PBS로 10cm 접시의 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포를 0.25% 트립신 2밀리리터와 1밀리몰 EDTA 용액에 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 5분 동안 습도를 조절합니다. 세포에 8ml의 성장 배지를 추가합니다.
200마이크로리터 피펫 팁이 부착된 파스퇴르 이송 피펫을 사용하여 세포를 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 000G에서 원심분리합니다. 그런 다음 흡입기를 사용하여 상층액을 제거합니다.
세포 펠릿 및 1에 PBS를 추가하고 4개의 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G를 분리한다. PBS를 제거한 후, 1 % sarcosil을 함유 한 A68 완충액 1 밀리리터에 세포 펠릿을 초음파 처리합니다. 300 마이크로리터의 세포 용해물을 100 마이크로리터의 4회 시료 완충액과 혼합합니다.
혼합물을 섭씨 100도에서 열 블록에서 10분 동안 배양하여 세포 분획을 준비합니다.
