Unsere Forschung konzentriert sich auf progressive neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Akkumulation des Kernproteins TDP-43 im Zytoplasma gekennzeichnet sind, wie z.B. ALS oder FTLD-TDP. Unser Ziel ist es zu verstehen, wie sich TDP-43-Pathologien auf Prionen-ähnliche Weise im Gehirn ausbreiten. Wir haben bereits gezeigt, dass die Freisetzung von TDP-43 über extrazelluläre Vesikel durch die Dysregulation der Autophagie vermittelt wird.
Progranulin des von FTLD-TDP erleichtert diesen Prozess. Die nächste Herausforderung besteht darin, zu klären, wie die Autophagie die Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikel, die TDP-43 enthalten, reguliert, was zur Entdeckung therapeutischer Ziele für ALS oder FTLD-TDP führen könnte. Nehmen Sie zunächst die kultivierten HeLa-Zellen, zählen Sie sie mit einem Zellzähler und säen Sie eine mal zehn hoch sechs Zellen auf einer sechs Zentimeter großen Platte, die ein Kulturmedium enthält.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden. Bereiten Sie als Nächstes eine 20-mikromolare siRNA-Lösung vor. Mischen Sie 100 Mikroliter reduziertes Serummedium und drei Mikroliter siRNA in einem Röhrchen mit niedriger Retention, um Lösung A herzustellen. Mischen Sie dann 100 Mikroliter reduziertes Serummedium und fünf Mikroliter Transfektionsreagenz in einem Röhrchen mit niedriger Retention, um Lösung B herzustellen. Mischen Sie danach Lösung A und Lösung B und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Geben Sie nun die Mischung aus Lösungen A und B in das Medium, das für die Kultivierung der HeLa-Zellen verwendet wird, und inkubieren Sie es 24 Stunden lang. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit PBS und setzen Sie die Zellen fünf Minuten lang 500 Mikrolitern 0,25 % Trypsin und einer millimolaren EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und kontrollierter Luftfeuchtigkeit aus. Geben Sie anschließend 2,5 Milliliter des Kulturmediums zu den Zellen und bereiten Sie mit einer Pasteur-Transferpipette mit einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze eine Einzelzellsuspension vor.
Nach dem Zählen der Zellen eine mal zehn hoch sechs Zellen auf einer zehn Zentimeter großen Platte aussäen und inkubieren, wie bereits gezeigt. Am Ende der Inkubation ist das Nährmedium vorzubereiten, das entweder Vehikel oder 100 nanomolare Bafilomycin A1 enthält. Dann werden die Zellen dem Medium ausgesetzt, das entweder Vehikel oder 100 nanomolare Bafilomycin A1 enthält, und 24 Stunden lang inkubieren. Sammeln Sie am nächsten Tag das gesamte Nährmedium von der 10-Zentimeter-Platte.
Füllen Sie das gesammelte Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 3.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zelltrümmer zu entfernen. Um die extrazelluläre Vesikelfraktion P1 zu isolieren, wird der Überstand nach der Zentrifugation bei 3.000 G in ein Zentrifugationsröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius.
Zur Isolierung der extrazellulären Vesikelfraktion P2 wird der Überstand nach der Zentrifugation bei 20.000 G in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie es eine Stunde lang bei 110.000 g bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die überschüssige Feuchtigkeit im Röhrchen mit einem Labortuch abgewischt haben, suspendieren Sie die restlichen Pellets im Zentrifugationsröhrchen in 50 Mikrolitern zweifachem Probenpuffer, um die extrazelluläre Vesikelfraktion P1 vorzubereiten.
Anschließend den Überstand durch Dekantieren entfernen. Wischen Sie die überschüssige Feuchtigkeit im Inneren des Röhrchens mit einem Labortuch ab und resuspendieren Sie die restlichen Pellets im Ultrazentrifugationsröhrchen in 50 Mikrolitern Zweifach-Probenpuffer, um die extrazelluläre P2-Vesikelfraktion vorzubereiten. Inkubieren Sie die extrazellulären Vesikelfraktionen P1 und P2 bei 100 Grad Celsius auf einem Wärmeblock für 10 Minuten.
Nachdem Sie das Kulturmedium von der 10-Zentimeter-Platte in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt haben, waschen Sie die Zellen in der 10-Zentimeter-Schale mit PBS. Setzen Sie dann die Zellen fünf Minuten lang zwei Milliliter 0,25 % Trypsin und eine millimolare EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und kontrollierter Luftfeuchtigkeit aus. Geben Sie acht Milliliter Wachstumsmedium in die Zellen.
Pipettieren Sie die Zellen mit einer Pasteur-Transferpipette mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und bei 1.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand mit einem Aspirator.
Geben Sie PBS zum Zellpellet und zentrifugieren Sie es bei 1.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Entfernung des PBS wird das Zellpellet in einem Milliliter A68-Puffer mit 1 % Sarkosil beschallt. Mischen Sie 300 Mikroliter des Zelllysats mit 100 Mikrolitern Vierfach-Probenpuffer.
Inkubieren Sie die Mischung bei 100 Grad Celsius auf einem Heizblock für 10 Minuten, um die Zellfraktion vorzubereiten.
