La nostra ricerca si concentra sulle malattie neurodegenerative progressive caratterizzate dall'accumulo della proteina nucleare TDP-43 nel citoplasma, come la SLA o la FTLD-TDP. Il nostro obiettivo è capire come le patologie della TDP-43 si diffondano nel cervello in modo simile ai prioni. In precedenza abbiamo scoperto che il rilascio di TDP-43 attraverso le vescicole extracellulari è mediato dalla disregolazione dell'autofagia.
La progranulina del FTLD-TDP facilita questo processo. La prossima sfida è chiarire come l'autofagia regoli la produzione e il rilascio di vescicole extracellulari contenenti TDP-43, il che potrebbe portare alla scoperta di bersagli terapeutici per la SLA o FTLD-TDP. Per iniziare, prendi le cellule HeLa coltivate, contale usando un contatore di cellule e semina una volta dieci alla potenza di sei cellule su una piastra di sei centimetri contenente un terreno di coltura.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità controllata per 24 ore. Successivamente, preparare una soluzione di siRNA da 20 micromolari. Mescolare 100 microlitri di terreno sierico ridotto e tre microlitri di siRNA in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione A.Quindi, mescolare 100 microlitri di terreno sierico ridotto e cinque microlitri di reagente di trasfezione in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione B.Successivamente, mescolare la soluzione A e la soluzione B, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti.
Aggiungere ora la miscela delle soluzioni A e B al terreno utilizzato per la coltura delle cellule HeLa e incubare per 24 ore. Il giorno successivo, lavare le cellule con PBS ed esporre le cellule a 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e una soluzione millimolare di EDTA a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità controllata per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 2,5 millilitri di terreno di coltura alle cellule e, utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 20 microlitri attaccato, preparare una sospensione a cellula singola.
Dopo aver contato le cellule, seminare una volta dieci alla potenza di sei cellule su una piastra di dieci centimetri e incubare, come dimostrato in precedenza. Al termine dell'incubazione, preparare il terreno di coltura contenente veicolo o 100 nanomolari di bafilomicina A1. Quindi esporre le cellule al terreno contenente veicolo o 100 nanomolari di bafilomicina A1 e incubare per 24 ore. Il giorno seguente, raccogli tutto il terreno di coltura dalla piastra da 10 centimetri.
Trasferire il terreno raccolto in una provetta da 15 millilitri e centrifugarlo a 3.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Per isolare la frazione di vescicola extracellulare P1, trasferire il surnatante dopo centrifugazione a 3.000 G in una provetta da centrifugazione. Centrifugare la provetta a 20.000 G a quattro gradi Celsius per un'ora.
Per l'isolamento della frazione di vescicola extracellulare P2, trasferire il surnatante dopo centrifugazione a 20.000 G in una provetta da ultracentrifuga. Centrifugare a 110.000 g a quattro gradi Celsius per un'ora. Dopo aver rimosso l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, risospendere i pellet rimanenti nella provetta da centrifugazione in 50 microlitri di tampone campione a due tempi per preparare la frazione di vescicola extracellulare P1.
Quindi rimuovere il surnatante mediante travaso. Rimuovere l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio e risospendere i pellet rimanenti nella provetta per ultracentrifugazione in 50 microlitri di tampone campione due volte per preparare la frazione di vescicola extracellulare P2. Incubare le frazioni di vescicole extracellulari P1 e P2 a 100 gradi Celsius su un blocco termico per 10 minuti.
Dopo aver trasferito il terreno di coltura dalla piastra da 10 centimetri in una provetta da 15 millilitri, lavare le cellule nella piastra da 10 centimetri con PBS. Quindi esporre le cellule a due millilitri di tripsina allo 0,25% e a una soluzione millimolare di EDTA a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità controllata per cinque minuti. Aggiungi otto millilitri di terreno di coltura alle cellule.
Utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 microlitri attaccato, pipettare le cellule per preparare una sospensione a cellula singola. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugarla a 1.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore.
Aggiungere il PBS al pellet della cella e centrifugare a 1.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il PBS, sonicare il pellet cellulare in un millilitro di tampone A68 contenente l'1% di sarco. Miscelare 300 microlitri di lisato cellulare con 100 microlitri di tampone campione quattro volte.
Incubare la miscela a 100 gradi Celsius su un blocco termico per 10 minuti per preparare la frazione cellulare.
