Araştırmamız öncelikle DNA onarımı ve yaşlanma arasındaki bağlantıya odaklanmaktadır. Özellikle, farklı laminopati bozukluklarına bakıyoruz ve bunların DNA onarımını nasıl etkileyebileceğini öğrenmek istiyoruz. Hutchinson-Gilford progeria sendromu olarak bilinen erken yaşlanma ve kısa bir yaşam süresi ile ilişkili bir laminopati bozukluğunun aslında artan miktarda DNA hasarı ve kesin olmayan DNA onarımı ile ilişkili olduğunu gösterdik.
Laboratuvarımız, laminopati hastaları için potansiyel tedavilerin etkisini araştırmak ve bu yaklaşımların DNA onarımı ve DNA hasarı üzerinde de olumlu bir etkisi olup olmayacağını öğrenmek istiyor. Başlamak için, forseps kullanarak steril 6 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir kapak fişi yerleştirin. 6 oyuklu plakadaki her bir oyuğa iki mililitre takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM ekleyin.
Şişede kültürlenen HeLa hücrelerinden ortamı aspire edin ve 15 mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri yıkamak, PBS'yi aspire etmek ve hücreleri kaplamak için iki mililitre tripsin-EDTA eklemek için şişeyi hafifçe döndürün. Tripsin ile kaplanmış şişeyi, hücrelerin ayrılmasına izin vermek için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatöre iki dakika boyunca yerleştirin.
Daha sonra, tripsinizli hücreleri içeren şişeye sekiz mililitre takviye edilmiş DMEM ekleyin ve topaklanan hücreleri ayırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu şişeden 15 mililitrelik bir polistiren tüpe toplayın. Hücreleri saydıktan sonra, 500.000 hücreyi 6 oyuklu plakadaki kapak fişlerinin her birine doğrudan damla damla ekleyin.
Hücrelerin gece boyunca büyümesine izin vermek için plakayı 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Hücre fiksasyonu için, ertesi gün ortamı 6 oyuklu plakanın kuyularından aspire edin. Hücreleri yıkamak için her bir kuyucuğa iki mililitre PBS ekleyin ve tüm PBS'yi kuyulardan tamamen aspire edin.
Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her bir oyuğa iki mililitre% 4'lük formaldehit çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi kuyucuklardan tamamen aspire edin. Daha sonra, her kuyucuğa iki mililitre geçirgenlik çözeltisi ekleyin. Solüsyonu oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından tamamen aspire edin.
Hücreleri her kuyucukta iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra tamamen aspire edin. Tüm PBS kuyucuklardan aspire edildikten sonra, hücreleri immünofloresan boyama için bloke etmek için her bir oyuğa iki mililitre antikor seyreltici tamponu veya ADB ekleyin.
Nazik orbital çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Engelleme süresinin sonuna doğru. ADB'de lümen B1 ve çift sarmallı DNA antikorlarını karıştırarak birincil antikor seyreltmesini hazırlayın.
Kuluçka süresinin sonunda, ADB'yi kuyulardan aspire edin. Düz bir yüzeye bir parça parafin filmi bantlayın ve alanın işlenmekte olan tüm kapak fişlerini barındıracak kadar geniş olduğundan emin olun. Her kapak kayması için, herhangi bir kabarcıktan kaçınarak parafin film üzerine 75 mikrolitre birincil antikor seyreltmesini pipetleyin.
Forseps kullanarak, her bir kapak kayma hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde antikor damlacığının üzerine yerleştirin. Kuluçka kapak kızaklarını 6 oyuklu plakanın kapağı ile örtün ve kapak kızaklarının oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin. Daha sonra forseps kullanarak, kapak fişlerini parafin filminden dikkatlice çıkarın ve hücre tarafı yukarı bakacak şekilde 6 oyuklu plakaya geri yerleştirin.
Kapak fişlerini iki mililitre PBST ile beş dakika boyunca üç kez sallayarak yıkayın. Son yıkama sırasında, ikincil antikor seyreltmesini hazırlayın. Son yıkamadan sonra PBST'yi tamamen aspire edin.
Para filme ikincil antikor ekleyin ve kapak fişlerini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde parafin film üzerine yerleştirin. Ardından, hücreleri ışıktan korumak için kapak kızaklarının üzerine hafif bir koruyucu kapak yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Forseps kullanarak, kapak fişlerini parafin filmden dikkatlice çıkarın ve hücre tarafının yukarı baktığından emin olarak 6 oyuklu plakaya geri yerleştirin, Daha sonra sırayla her biri% 70% 90 ve% 100 etanolden oluşan iki mililitre ekleyerek kapak fişlerini kurutun kuyucuklara, her bir çözeltinin çıkarılmadan önce bir ila iki dakika oturmasına izin verin.
Forseps kullanarak, kapak fişlerini kuyulardan çıkarın ve ışıktan koruyarak havayla kuruması için tüy bırakmayan bir mendil üzerine koyun. Kapak kızağı başına 20 mikrolitre montaj ortamı kullanarak kapak kızaklarını hücre tarafı aşağı bakacak şekilde cam mikroskop slaytlarına monte edin. Nükleer kanama, HeLa kontrol hücrelerindeki% 17'ye kıyasla, çekirdeklerin yaklaşık% 50'sinin bleb sergilediği HeLa ZMPST24 nakavt hücrelerinde daha yaygındı.
Ağırlıklı olarak HeLa ZMPSTE24 nakavt hücrelerinde DNA sızıntısı gözlenirken, HeLa kontrol hücrelerinde DNA sızıntısı gözlenmezken, gözle görülür nükleer kanama olmasa bile bazı ZMPSTE24 nakavt hücrelerinde DNA sızıntısı meydana geldi.
