Laboratuvarımız, tat bilgisinin kimyasalların tespitinden davranış üzerindeki etkisine kadar nöral devreler aracılığıyla nasıl işlendiğini incelemek için meyve sineğini model organizma olarak kullanır. Bu görüntüleme protokolünü, amino asitlere yanıt veren tat hücrelerini tanımlamak ve farklı iç durumların tat hücrelerinin bu temel besin maddelerine nasıl tepki verdiğini modüle edip etmediğini belirlemek için kullanıyoruz. Bu kalsiyum görüntüleme yaklaşımının bir avantajı, iç durumların bozulmadan kaldığı uyanık hayvanlardaki belirli hücrelerden tat kaynaklı nöral tepkilerin kaydedilmesine izin vermesidir.
Artık yeni Drosophila tüm beyin konektomundaki varsayılan tat devrelerini tanımlayabilir ve bu kalsiyum görüntüleme yaklaşımını kullanarak fonksiyonel nöronal dinamikleri in vivo olarak doğrulayabiliriz. Başlamak için, anestezi uygulanmış sineği bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Diseksiyon makası kullanarak, femoral tibial eklemdeki orta ve arka bacakları ve trokanterdeki dört bacağı çıkarın.
Vücudu aşağıda tutarken, başı görüntüleme odasının hedeflenen serviks yuvasının üzerinde olacak şekilde konumlandırmak için künt forseps kullanarak sineği kanatlarından alın. Makasın kör tarafını ve künt forsepsleri kullanarak, başı ve göğüs kafesi aynı anda yavaşça yuvaya itin. Sinek yuvaya güvenli bir şekilde girdikten sonra, arkaya doğru itin ve odanın önüne bakacak şekilde nazikçe yeniden konumlandırın.
Bir kürdanın ucuna küçük bir oje damlası koyun ve sineğin kafasını görüntüleme odasına sabitlemek için ince bir kat uygulayın. Ağda makinesini bir elinizle alın ve ucunda küçük bir balmumu damlası toplayın. Öte yandan, yarı keskin forseps kullanarak, bir maksiller palp tutun ve hortumu yavaşça dışarı çekin ve tam uzantıda tutun.
Ağda akmaya başlayana kadar ağda makinesinin ucunu hortumun tabanına yakın hazneye dokundurun. Hortumun tabanı ile temas etmek için hareket edin ve etiketleyici sensilli ile temastan kaçınarak milin yarısına kadar cilalayın. Ardından hortumu mümkün olduğunca düz bir şekilde tamamen uzatın.
Şimdi monte edilmiş sinekleri iyileşmek için 60 dakika boyunca bir nem odasına yerleştirin. Sinekleri nem odasından çıkarın. Çok keskin forsepsler kullanarak, her iki anteni de sıkıştırın, bir delik oluşturmak için kütikülü sıkıştırın ve keskin forsepslerin bir tarafını yerleştirin.
Forsepsleri kütikülün altından geçirerek beynin ilgi alanını kaplayan bölgeden çıkarın. Açıkta kalan beyni yıkamak için, kafaya yaklaşık 100 mikrolitre yapay hemolenf çözeltisi veya AHL ekleyin. Yıkadıktan sonra, beynin kurumasını önlemek için ince bir tabaka bırakarak AHL'yi çıkarın.
Keskin forseps kullanarak hava torbalarını ve beyni kaplayan büyük kalıntıları temizleyin. Özofagus bölgesini veya SEZ'i spesifik olarak görüntülemek için, yemek borusunu hortumun yakınındaki tabanda ve beyinden geçtiği noktada çok keskin forsepsler kullanarak kesin. SEZ'i ortaya çıkarmak için bu parçayı çıkarın.
Diseksiyon mikroskobu altında, 10 x 20 milimetrelik kapak kızağını görüntüleme odasının açılı yuvasına yerleştirin. Kılcal boruya yaklaşık iki mikrolitre su veya başka bir negatif kontrol yükleyin. Parçalanmış sineği bulun ve 10x havaya daldırmalı parlak alan objektifi kullanarak etikete odaklanın.
Kılcal damarı 10x görünümünün altındaki labellum ile hizalayın. Kılcal pozisyonu doğrudan labellumun önünde bırakın, yakın olduğundan ancak temas etmediğinden emin olun. İlgilenilen beyin bölgesini merkezlemek için sahneyi hareket ettirin.
40x objektif gibi daha yüksek büyütmeli bir suya daldırma hedefine geçin. Daldırma hedefi ile teması sağlamak için beynin üstüne yaklaşık 200 mikrolitre AHL ekleyin. İlgilendiğiniz alanda GCaMP ifadesini bulmak için 488 nanometre lazer gücüne geçin.
En az beş saniyelik temel floresan topladıktan sonra, stimülatörü, kılcal damar etiketi beş saniye boyunca kaplayacak şekilde manuel olarak hareket ettirin. Uyaranı çıkarın ve istediğiniz kadar yakalamaya devam edin. Ardından, kapak kayması, stimülatör ve etiketin doğru konumda kaldığını doğrulamak için AHL'yi çıkarın ve 10x parlak alana dönün.
Ardından görüntüleme odasını çıkarın ve ilk solüsyonu kılcal damardan çıkarmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Pipeti suyla yıkayın ve bir sonraki tastanttan yaklaşık iki mikrolitreyi kılcal boruya pipetleyin. Gr64f GCaMP sineklerindeki nispi floresan değişimi, sakaroz stimülasyonu için suya kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti ve bu da tatlı tat alma reseptör nöronlarının güçlü ve sürekli bir tepkisini gösterdi.
Sükroz stimülasyonu için nispi tepe floresansı, su için olandan önemli ölçüde daha büyüktü. Gr66a GCaMP sineklerindeki floresan değişimi, kafein stimülasyonu için suya göre önemli ölçüde daha yüksekti ve kafein başlangıcına ve uzaklaştırılmasına yanıt gösterdi. Gr66a sineklerindeki akson terminallerinin projeksiyon paterni, Gr64f'ninkinden farklıydı ve acı ve şeker algılayıcı tat reseptör nöronlarının anatomik ayrışmasını gösterdi.
