Araştırmamız, Drosophila melanogaster'deki nöral devrelerin termotaksi ve gebelik gibi davranışları nasıl yönettiğini incelemek için optogenetik araçlar kullanıyor. Belirli nöronları ışıkla kontrol ederek, bu devrelerin duyusal tepkileri nasıl yönlendirdiğini ve karar vermeyi yüksek hassasiyetle nasıl etkilediğini anlamayı amaçlıyoruz. Optogenetik, sinirbilimde değerli bir teknolojidir ve ışığı kullanarak nöral aktivitenin hassas kontrolünü sunar.
Drosophila melanogaster'de, CsChrimson ve GtACR2 gibi araçlar, nöronların hedefli aktivasyonunu ve inhibisyonunu sağlar. Bu araçlar, araştırmacıların nöral devreleri manipüle etmelerine, davranışları incelemelerine ve sensör tepkilerini yüksek özgüllükle keşfetmelerine olanak tanır. Protokolümüz, Drosophila'da optogenetik manipülasyona basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır.
Ticari olarak mevcut materyalleri kullanır ve bu da onu sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlarda ve sınıflarda erişilebilir kılar. Yöntemler aynı zamanda son derece uyarlanabilir olup, minimum teknik zorlukla çekici ve kaçınma davranışlarının incelenmesini sağlar. Başlamak için, ısıtma hücrelerinde GtACR2 eksprese eden erkek ve dişi Drosophila sinekleri elde edin.
İki çelik plakayı, kenarları birleşecek şekilde ayrı ocaklar üzerine hizalayın. Üstüne plastik bir tabaka koruyucu yerleştirin ve hareketi en aza indirmek için bantla sabitleyin. Şimdi, arka plan gürültüsü sinyallerini azaltmak için sayfa koruyucunun üzerine bir parça beyaz kağıt yerleştirin ve beyaz kağıdın üzerine şeffaf bir plastik kapak yerleştirin.
Ardından, kamerayı ve mavi ışığı deney yüzeyinin yaklaşık 12 santimetre yukarısına yerleştirmek için polistiren köpük kutunun altında bir delik açın. Etkinleştirmeyi sağlarken parlamayı en aza indirmek için kamerayı ve mavi ışığı konumlandırın. Kamerayı bir saniyelik zaman atlamalı, dar alan ve 4.000 x 3.000 piksel çözünürlükle kayıt yapacak şekilde ayarlayın.
İlgili çelik plakalarda 25 artı veya eksi bir santigrat derece ve 31 artı veya eksi bir santigrat derece yüzey sıcaklığını korumak için ocak gözü ayarlarını yapın. Her denemeden önce ve sonra bir yüzey sıcaklığı probu kullanarak çelik plakaların sıcaklıklarını izleyin. Ardından, plastik kapağı 25 santigrat derece çelik plakanın üzerine yerleştirin.
Şimdi, bir sinek aspiratörü kullanarak, kapağın altına tek bir sineği yavaşça bırakın. 10 lüksün altında loş ışık oluşturmak için kutuyu deney alanının üzerine yerleştirin ve sineğin bir dakika boyunca alışmasına izin verin. Alışma süresinden sonra, kutuyu kaldırın ve plastik kapağı, kapağın merkezi çelik levha sınırıyla aynı hizaya gelecek şekilde hızlı bir şekilde ayarlayın.
Denemeyi başlatın, kamerayı açın ve 20 kilolux'te mavi ışığı açın. Sineklerin aktivitesini iki dakika boyunca yakalayın. İki dakika sonra kamerayı ve ışığı kapatın.
Sinekleri aspiratörü kullanarak atın. Açlıktan ölmüş erkek ve dişi sinekleri uyuşturun, buz üzerinde tatlı tat reseptör nöronlarında CsChrimson eksprese edin. Bir cam slayt üzerine yedi ila 10 küçük nokta tutkal uygulayın.
Hareketi en aza indirmek için göğüs kafesinin ve kanatların yapıştırıcıya temas ettiğinden emin olarak, her bir tutkal noktasına bir sinek ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Yapışkan yüzey alanını artırmak için kanatları her iki tarafa doğru havalandırın. Islak kağıt havluları bir nem kutusuna yerleştirin ve slaytları kutuya aktarın.
İki saatlik iyileşmeden sonra, slaytı mikroskobun altına yerleştirin. Sinekleri doyurmak için bir damla su vermek için bir şırınga kullanın ve susuzluğa bağlı hortum uzantılarını önleyin. Kırmızı bir lazer işaretçiyi manuel olarak tutun ve 700 lükste tek bir sineğin hortumuna veya kafasına kırmızı ışık tutun.
30 saniyelik bir pencere içinde mikroskop aracılığıyla hortum uzatma yanıtını gözlemleyin. Işık kaynaklı hortum uzantısını test ettikten sonra,% 4 sükroza verilen yanıtı inceleyin. Şırınga iğnesinin ucuna bir damla sakaroz atın ve sineğin hortumuna yaklaştırın.
İlk olarak, deney için sinek labirentini birleştirin. Karanlık veya düşük ışık koşullarında, 10 erkek ve 10 dişi CsChrimson eksprese eden sineği yükleme tüpüne yerleştirin ve tutma odasına bağlayın. Asansörü eğin ve sinekleri tutma odasına taşımak için tüpe hafifçe vurun.
Sinekleri tutma odasına aktardıktan sonra, yükleme borusu ile test borusu delikleri arasına indirmek için asansörü kullanın. Ardından yükleme borusunu çıkarın. Işığı açmadan sinek labirentini 1.000 miliamper kırmızı ışık kaynağından yaklaşık 13 santimetre uzağa yerleştirin.
Tutma haznesi test tüpü delikleriyle aynı hizaya gelene kadar asansörü indirin, böylece sineklerin folyo ile sarılmış ve üstü açık test tüpleri arasında serbestçe hareket etmesine izin verin. Aynı anda, CsChrimson'ı etkinleştirmek için yaklaşık 40 kilolux'te kırmızı ışığı açın. Sineklerin bir dakika boyunca kırmızı ışığa maruz kalan tüp ile gölgeli tüp arasında seçim yapmasına izin verin.
Bir dakika sonra, yükleme borusu ile test borusu delikleri arasındaki asansörü kaldırın. Sinekleri her tüpten çıkarın. Onları sayın ve sayıları kaydedin.
Her denemeden sonra sinek asansörünü ve sinek labirentini damıtılmış su kullanarak temizleyin. Mavi ışık, optogenetik, termotaktik, pozisyonel tercih testinde, sinekler kontrol koşulları altında 31 santigrat derece tarafından kaçınırken, ATR takviyesi ile mavi ışıkta sinekler 25 ila 31 santigrat derece arasında bir tercih göstermedi, bu da GtACR2 aktivasyonu yoluyla HC nöron inhibisyonunu gösterir. Kontrol koşulları altında, sinekler minimal hortum uzatma tepkisi gösterirken, ATR takviyesi ile kırmızı ışık aktivasyonu, CsChrimson tarafından tatlı algılama nöronlarının aktivasyonunu gösteren önemli hortum uzaması ile sonuçlandı.
Kırmızı ışık, optogenetik, sinek labirent testinde, kontrol grupları tercih göstermezken, ATR takviyesi ile kırmızı ışık aktivasyonu, sineklerin açıkta kalan tüpten kaçınmasına neden oldu ve bu da CsChrimson tarafından acı algılayıcı nöron aktivasyonunu gösterdi.
