ソース: パーチェットティボー^1,2,3, ムニエ・シルヴァン^1,2,3, ソフィー・ノヴォール^{ト 4}, レイチェル・ゴルブ^1,2,3
リンパポイシス^{のための1}ユニット、免疫学科、パスツール研究所、パリ、フランス
² INSERM U1223, パリ, フランス
³ユニバーシテ パリ ディデロ, ソルボンヌ パリ シテ, セルレ パストゥール, パリ, フランス
⁴フローサイトメトリープラットから, サイトメトリーとバイオマーカー UtechS, 翻訳科学センター, パスツール研究所, パリ, フランス

免疫システムの全体的な機能は、感染性の生物や他の侵略者から体を守るためにあります.白血球、または白血球は、免疫系の主要なプレーヤーです。感染すると、それらは活性化され、免疫応答を開始する。白血球は、生物学的、物理的、および/または機能的(例えば、サイズ、粒度、分泌)であり得る異なるパラメータに基づいて、様々なサブ集団(例えば、骨髄細胞、リンパ球、樹状細胞)に分けることができる。白球を特徴付ける一つの方法は、主に受容体である表面タンパク質を介してです。各白色細胞集団は、集団間のサブセットを定義できる受容体(例えば、細胞傷害性、活性化、移行受容体)の特定の組み合わせを発現する。免疫系は広範囲の細胞集団を包含するので、免疫応答への参加を解読するためにそれらを特徴付ける必要があります。

フローサイトメトリー(FCまたはFCM)は、細胞表面および細胞内分子の発現を分析し、異種細胞混合物中の異なる細胞タイプを特徴付け、定義するための広く使用されている方法である。フローサイトメーターは、流体、光学、エレクトロニクスの3つの主要なサブシステムで構成されています。流体システムは、レーザーの前を1つずつ通過できるように、流れの中で細胞を輸送します。光学系は、粒子を照らす光源(レーザー)、得られた光を照らす光学フィルター、蛍光信号から適切な検出器で構成されています。最後に、エレクトロニクスシステムは、検出された光信号をコンピュータで処理できる電子信号に変換します。個々のセルがレーザー光の前を通過すると、光が散乱します。ビームの前にある検出器は、前方散乱(FS)と側面測定側散乱(SC)に複数の検出器を測定します。FSは細胞サイズと相関し、SCは細胞の粒度に比例する。このようにして、細胞集団は、多くの場合、その大きさと粒度のみの違いに基づいて区別することができます。

細胞の大きさ、形状、複雑さを解析することに加えて、フローサイトメトリーは細胞表面受容体の発現を検出するために広く使用されています(1)。これは、既知の細胞特異的受容体に結合するフルオロクロム標識モノクローナル抗体を使用することによって達成される。励起時に、これらの結合したフルオロクロムは、検出およびスコア付け可能な発光波長と呼ばれる特定の波長の光を放出します。蛍光測定は、フルオロクロム標識細胞表面受容体に関する定量的および定性的なデータを提供します。血液学者は、免疫細胞集団の治療フォローアップのためにFCを最初に使用した(2)。現在では、免疫表現、細胞生存率、遺伝子発現、細胞数計、GFP分析など幅広い用途に使用されています。

FACS(蛍光活性化細胞選別機)は、蛍光標識を用いて細胞の集団を亜集団に分類する特殊なタイプのフローサイトメトリーです。従来のフローサイトメトリーと同様に、最初のFS、SC、蛍光データが収集されます。次に、機械は電荷(負または正)を適用し、静電偏向システム(電磁石)は、適切なチューブに細胞を含む帯電液滴の収集を容易にする。

図 1: FACS の概略表現。試料(1)はFACS(2)で吸引され、レーザー(3)の前に通過する。細胞蛍光は蛍光検出器(4)によって感知される。最後に、細胞は液滴に組み込まれ、目的の細胞は偏向板(5)によって偏向し、集採取管(6)に集まる。残りのセルはゴミ箱に入ります (7)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

FACS の並べ替えの側面には、多くの利点があります。RT-qPCR、細胞周期、サイトカイン分泌などの遺伝子発現の解析など、免疫系における特定の細胞の役割を理解するのに役立つ多くのテストがあります。しかし、明確で具体的な結果を得るために、細胞を上流に精製する必要があります。ここで、FACSは有用であり、所望の細胞は非常に高い純度で選別することができ、信頼性が高く、再現可能な結果をもたらす。FACSはまた、核または他の細胞内染色に基づいて、および表面受容体の存在、不在、および密度に応じて細胞をソートするために使用することができます。FACSは現在、細胞の亜集団の精製のための標準的な技術であり、同時に4つの集団までソートする能力を有する。

このラボ演習では、脾臓白血病を単離する方法と、FACSを用いて脾臓白血病細胞混合物からBリンパ球細胞を特異的にソートする方法を示す。