1. セットアップ

バッファーと試薬

1. カルシウムまたはマグネシウムを使用せずに生菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)
2. コーティングバッファー- 滅菌PBSまたは炭酸塩バッファーのいずれか
3. PBSにおけるアッセイ希釈剤- 10%胎児ウシ血清(FBS)
4. 細胞培養培地- 10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを含むRPMI 1640
5. 洗浄バッファー- 0.05% Tween20 を含む PBS
6. 二重蒸留水(ddH₂O)
7. 検出基板-100mg AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を10mL DMF(N,N,ジメチルホルミド)で検出した。

機器

8. ラミナーフローフード
9. 加湿インキュベーター(37°C、5%CO2に設定)
10. 自動ELISPOTリーダーまたは解剖顕微鏡

材料

11. エリスポットプレート
12. 滅菌および非滅菌貯留所
13. ピペッタとヒント
14. 滅菌血清ピペット
15. 滅菌、円錐状ポリプロピレンチューブ
16. プレート洗浄用スクイーズボトル2本

アッセイ特異的試薬

17. 細胞-一次細胞または細胞株(ここでは、C57BL/6マウス由来の脾細胞を用いた)
18. 覚醒剤-ミトゲンまたは抗原(ここでは、ソルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA、50ng/mL)およびイオノマイシン(1μM)を用いた。
19. 一次抗体-ビオチン化抗サイトカイン検出抗体(アッセイ希釈剤で2μg/mLに希釈)
20. 二次抗体- ストレプトアビジン-ワサビ性ペルオキシダーゼ(SAv-HRP)

2. 手続き

コーティング

1. 条件を無菌および層状流フードの中に保ち、精製された抗サイトカイン捕捉抗体を無菌コーティングバッファー内の0.5-4.0 μg/mLの最終濃度に希釈する。(注:IFN-γおよびIL-6の場合は5 μg/mLを使用)。
2. 捕捉抗体溶液100μL/ウェルをELISPOTプレートに移します。
3. プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールします。
4. プレートを4°Cで一晩インキュベートします。

ブロック

5. 翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。
6. 次に、各ウェルに200μLの細胞培養培地を添加する。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。
7. プレートカバーを交換し、37°Cで2時間インキュベートします。

めっきと細胞の活性化

8. プレートがインキュベートされている間、細胞培養培地中に50ng/mL PMAおよび1μMイオノマイシンを含む2Xマイトゲン溶液を調出す。
9. 次いで、標的細胞懸濁液を2x10⁶細胞/mLのストック濃度に調出する。
10. インキュベーションが完了したら、層流フード内の無菌ワイプにプレートを素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を取り除きます。
11. 次に、ストックセル懸濁液の2Xシリアル希釈を生成する。そうするには、まずELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備された細胞懸濁液ストック溶液の200 μLを追加します。
12. 次に、細胞ストック溶液を含む行の下のプレートの次の5行にプレーン細胞培地の100 μLを加える。
13. その後、一番上の行から直下の行にセルラー懸濁液の100 μLをピペッティングして2Xシリアル希釈を行います。この溶液を上下にゆっくりとピペッティングして適切な混合を行い、セルの分配を均等にします。
14. 残りの 4 行に対してこのプロセスを繰り返します。
15. 6 行目はカルチャ メディアのみに残します。これは、実験的な制御として機能します。
16. 次に、準備されたマイトゲン溶液の100 μLをプレートの最初の5列の実験井戸に加える。制御ウェルと6列目に、マイトゲンを含まない細胞培養培養培養剤の100μLを添加する。
17. プレートカバーを交換し、プレートを37°C、5%CO₂をインキュベーターで20~48時間交換します。(注:20~24時間は通常、IL-2およびTNF-αを検出するのに十分ですが、IL-4およびIFN-γには48時間が最適です。

検出

一次抗体

18. アッセイ希釈剤中の2μg/mLの濃度に対する抗体を検出するバイオチン化抗サイトカインを調製する。
19. PBSで0.05%のTween-20を混合することにより、この時点で洗浄バッファーの20〜25 mLを調製します。
20. インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、シンクの上に素早く反転して、井戸からすべての液体を除去します。(注:この時点の後、プレートはもはや無菌状態に保つ必要はありません)。
21. 次いで、各ウェルに〜200μL洗浄バッファーを加えてプレートを洗浄する。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。合計 5 回の洗い流しの場合は、このプロセスを繰り返します。
22. 次に、希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体溶液を各ウェルに100μLを添加する。室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。

二次抗体

23. インキュベーションが完了したら、シンク上のプレートを反転してフリックして検出抗体を排出します。
24. 前と同様に、プレートを〜200μL洗浄バッファーで5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。
25. 次に、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100μL添加する(アッセイ希釈剤で予め決定された最適濃度に希釈)。
26. プレートカバーを交換し、室温で37°Cで1.5~2時間インキュベートします。

基板

27. インキュベーション後、使用の15分以内に、まずメーカーの指示に従ってAEC基板溶液を活性化する。
28. 次に、井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
29. 次に、直ちに各ウェルに100μLのAEC基板溶液を添加する。
30. スポットの発達を監視しながら、室温でプレートを10~20分間インキュベートします。
31. プレートを水ですすいで、流しの上でプレートをフリックして反応を止めます。
32. ペーパータオルにプレートをブロットし、プレートが一晩または完全に乾燥するまで乾燥させます。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。

3. データ取得・分析

1. 乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。ここでは、CTL免疫スポットリーダーが使用されるが、このプロトコルは、任意のリーダーに適合させることができる。
2. まず楽器の電源を入れ、次にコンピュータの電源を入れます。次に、CTLプログラムを開き、「スキャンカウント」をクリックします。
3. トレイを「イジェクト」押してマシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOTプレートとアダプターの行「A」を揃えます。
4. 保存するファイル名と場所を選択し、プレートをトレイにロードします。
5. 次に、ソフトウェアの「ロード」をクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。
6. 「カウント後開始」を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理「QC」ソフトウェアを開いてデータを分析し、スポット数をカウントします。

ノート：

1. 細胞の最小数は、予備実験で決定する必要があります。最適なスポット数は~50/ウェルです。読み込まれるセルが多すぎると、個別のスポットを検出するのが難しくなります。さらに、細胞は重なり合い、膜上に単層を形成しない可能性があるため、検出のレベルが低下する可能性があります。
2. 実験を最適化する際には、標的タンパク質の期待発現レベルを考慮する。発現が低いほど、ウェルあたりに必要なセル数が多くなります。
3. ELISAとは異なり、プレートウォッシャーを使用するよりも、プレートを手洗いする方が良いです。ELISPOTプレートはより繊細であり、PVDF膜の穿刺を避ける必要があります。
4. スポットが汚れる可能性があるため、インキュベーション期間中のプレートの動きを制限する必要があります。
5. 直接光にさらされるとスポットがフェードするので、プレートは暗闇の中に保管する必要があります。