1. 準備

1. 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
2. すべての解剖ツールを洗剤で洗い、次に70%のエタノールで洗い、清潔なペーパータオルで乾かします。
3. 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の200 mLを調調します。

2. 解剖

1. スピーヌ位置の解剖プレートに安楽死マウスをピン留めします。
2. はさみと鉗子を使用して、胸腔にアクセスするために縦腹腔切り目を行います。
3. 心臓の上に位置する胸腺へのアクセスを得るために心臓を削除します。次に、2つの白い葉で構成され、心臓の上の胸腔に位置する胸腺を識別します。
4. 鉗子を使用して慎重に胸腺を取り外し、HBSS 2%FCSの5 mLでペトリ皿の上に置きます。

3. 免疫細胞分離

1. 同じペトリ皿の上に40 μmセルストレーナーに胸腺を置きます。同じ皿でそれを解離するためにプランジャーで胸腺をつぶします。
2. 解離した胸腺と流体を15 mL遠心管に移します。
3. 5 mLのHBSS 2%FCSでペトリ皿を洗浄し、洗浄した媒体も同じ遠心管に移します。
4. チューブを20°Cで7分間370 x gで遠心し、ペレットを避けて上清を捨てます。
5. 赤血球をlyseseにアセテートカリウムの2mLで再濁させる。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を使用して最大 14 mL の音量を構成します。
6. 20°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの5 mLでペレットを再懸濁します。
7. トリパンブルー染色アッセイを用いて細胞濃度を推定し、HBSS 2%FCSの適切な体積を用いて最終細胞濃度を10⁷細胞/mLに調整する。

4. 免疫細胞の磁気標識

1. FACSチューブを2本取ります。1つのチューブに「非濃縮T細胞」、および他のチューブを「濃縮T細胞」と標識し、磁気標識を用いて分離する。
2. 2つのFACSチューブのそれぞれに細胞溶液を分配する。
3. 20°Cで3分間370 x gで「濃縮T細胞」チューブを遠心分離し、ペレットを避けて上清を廃棄します。
4. 抗CD3ビオチン化抗体ミックスの250μLでペレットを再ステースする(表1、ミックス1)。

ミックス	ラベリング試薬	希釈
1	抗CD3ビオチン化抗体	1/400 (HBSS 2% FCS内)
2	ストレプトアビジン結合ビーズ	1/5 (HBSS 2% FCS内)
3	アンチCD3 BV421	1/200 (HBSS 2% FCS内)

表1:抗体混合組成物。ミックス1と2は磁気分離に使用されます。ミックス3は、磁気分離後の細胞濃縮を評価するために使用される。

5. 細胞懸濁抗体混合物を暗闇の4°Cで15分間インキュベートする。
6. 両方のチューブにHBSS 2%FCSの3 mLを追加し、20°Cで3分間370 x gで再度遠心分離します。
7. 上清を廃棄し、250 μL連鎖アビジン結合ビーズでペレットを再懸濁します(表1、ミックス2)。
8. 細胞混合物とビーズを氷の上で20分間インキュベートします。
9. 次に、HBSS 2%FCSの3 mLを追加し、20°Cで3分間370 x gで再びよく混ぜて遠心分離機を混ぜます。
10. HBSS 2% FCSの2 mLでペレットを再中断します。

5. CD3陽性細胞の磁気分離

1. 磁石の上にカラムを置き、HBSS 2%FCSの3 mLを加えてシステムを加湿させます。5分間待ちます。
2. 次に、ラベル付きセルを柱にピペトします。
3. セルサスペンションがカラムを通過した後、HBSS 2%FCSの3 mLでカラムX3を洗浄します。
4. 次に、磁石からカラムを取り出し、15 mLの回収管に入れます。
5. 標的細胞を溶出させるには、HBSS 2%FCSの5 mLをカラムに追加し、カラムをプランジャーで洗い流します。
6. HBSS 2% FCSの別の5 mLで溶出ステップを繰り返します。

6. フローサイトメトリーによる標的細胞濃縮の評価

1. 「濃縮T細胞」と標識されたFACSチューブに500μLのeluted細胞懸濁液を移す。「非濃縮T細胞」懸濁液の200μLを第2のFACSに移す。
2. 次いで、20°Cで7分間370 x gで両方のチューブを遠心分離します。
3. 上清を廃棄し、次に100μLの蛍光抗体ミックス3(表1参照)を両管に添加する。
4. 暗闇の中で4°Cで20分間両方のチューブをインキュベートします。
5. 次に、チューブにHBSS 2%FCSの3 mLを追加し、20°Cで3分間370 x gで遠心分離します。
6. 上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの250 μLで各チューブを再懸濁します。
7. ここで、フローサイトメトリーによるCD3陽性細胞濃縮率を評価する。

7. データ分析

1. 「FlowJo」アイコンを開き、「すべてのサンプル」ウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。
2. 「エンリッチされたTセル」ファイルをダブルクリックすると、X軸上に前方散布図(FSC-A)を表示するドットプロットとY軸上のサイドスキャッタ(SSC-A)が表示されます。
3. リンパ球集団を囲む「ポリゴン」をクリックします。
4. 次に、円で囲まれた人口をダブルクリックして新しいウィンドウを作成します。
5. Y 軸の"FSC-W"と X 軸の"FSC-A"を選択し、FSA-W 負のセルを丸で囲みます。「亜集団識別」ウィンドウで、セル母集団に「単一細胞」という名前を付けます。
6. 円で囲まれた人口をダブルクリックして、新しいウィンドウを作成します。Y 軸で「CD3」を選択し、CD3 陽性セルを丸で囲みます。「サブ人口識別」ウィンドウで、セル母集団に「T セル」という名前を付けます。
7. 「非濃縮T細胞」で繰り返します。
8. セルの人口を視覚化するには、[レイアウトエディタ]をクリックし、"Tセル"母集団を "エンリッチト T セル" ファイルと "非エンリッチト T セル" ファイルからタブにドラッグします。
9. CD3+リンパ球を表すドットプロットが表示されます。CD3+ 細胞は、CD3+ 濃縮チューブの対象の集団にのみ現れる必要があります。
10. ソートされた細胞におけるCD3+リンパ球の濃縮を評価するには、「テーブルエディタ」をクリックし、「濃縮T細胞」および「非濃縮T細胞」ファイルから「T細胞」母集団をテーブルにドラッグします。
11. 「統計」メニューで、[リンパ球の頻度]細胞を選択して、すべてのリンパ球の CD3+ 細胞の割合を確認し、[テーブルを作成]をクリックします。
12. パラメータ値が新しいテーブルに表示されます。「濃縮T細胞」の場合、CD3+細胞の周波数は約80%である必要があります。